STRESZCZENIE: Świeżość i jakość dostarczanych na rynek ryb i owoców morza stanowi istotny problem zarówno dla producentów, jak i dystrybutorów żywności. Ryby i pozostałe produkty rybołówstwa są towarami łatwo psującymi się, których jakość i świeżość mogą być oceniane różnymi metodami sprawdzającymi się doskonale w warunkach laboratoryjnych, ale zdecydowanie nieprzydatnymi dla przeciętnego konsumenta. W artykule przedstawiono wyniki badań wskaźników świeżości, których działanie opiera się na ich reakcji z lotnymi substancjami uwalnianymi podczas psucia się ryb. W badanych wskaźnikach z powodzeniem zastosowano barwniki syntetyczne, tj. czerwień metylową oraz naturalne barwniki spożywcze: kurkuminę i ekstrakt ze skórek winogron. Otrzymywane zmiany barwy oceniono metodami kolorymetrycznymi, a różnicę barw wskaźników przedstawiono za pomocą obliczonego parametru TCD (ang. Total Color Difference). Badania prowadzono w układach modelowych z wykorzystaniem amoniaku i w opakowanych próbkach psującego się filetu z dorsza. Wykazano, iż wskaźniki na bazie naturalnych barwników mogą być także użyteczne do kontroli jakości i świeżości żywności.
IN ENGLISH: The application of natural food dyes to the design of food freshness indicators; ABSTRACT: Freshness and quality of fishery products supplied to the market is an important problem faced by both producers and distributors of food. Fish and other fishery products are perishable goods, which quality and freshness can be assessed in the manner using traditional methods. These methods are ideal for the laboratory but are rather unsuitable for the average consumer. In these paper the freshness indicators based on reaction with volatile substances releasing during spoilage of fish have been studied. The artificial chemical compounds, methylene red, and natural dyes, curcumin or grape peel extract were successfully used as a pH indicator in analyzed freshness indicator. Their response was evaluated by the colorimetric analyses of color changes and the calculation of Total Color Difference (TCD) index values both in model research with ammonia solution and in packaging analyses with fresh cod samples. It has been shown that such indicators based on natural dyes may be useful to control the freshness and quality of food.
Świeżość i jakość dostarczanych na rynek ryb i owoców morza stanowi istotny problem, z jakim mierzą się zarówno producenci, jak i dystrybutorzy żywności. Ryby i pozostałe produkty rybołówstwa są towarami łatwo psującymi się, co jest związane przede wszystkim ze składem chemicznym tego rodzaju żywności, dużą podatnością na zanieczyszczenie mikrobiologiczne oraz wrażliwością na warunki przetwórstwa i dystrybucji [Green 2014, Ryder, Iddya i Ababouch 2014]. Jakość i świeżość ryb może być oceniana w tradycyjny sposób za pomocą metod organoleptycznych, chemicznych, instrumentalnych oraz mikrobiologicznych [Oehlenschläger 2014]. Metody, które doskonale sprawdzają się w warunkach laboratoryjnych, ze względu na koszty, wymagane wyposażenie i/lub konieczność zaangażowania wykwalifikowanego personelu są raczej nieprzydatne dla przeciętnego konsumenta, który chciałby mieć szybką i wiarygodną informację o stanie kupowanej i przechowywanej w domu żywności [Cierpiszewski 2016].
W celu szybkiej oceny stanu opakowanej żywności proponuje się stosowanie wskaźników świeżości działających w oparciu o adsorpcję substancji chemicznych uwalniających się do atmosfery opakowania podczas psucia się opakowanego produktu. W przypadku ryb i produktów rybnych substancjami tymi mogą być trimetyloaminy (TMA), inne lotne związki azotowe ujęte wraz z TMA w grupie substancji zwiększające ilość całkowitego azotu lotnych zasad azotowych (N-LZA, ang. Total Vola-tile Base Nitrogen, TVBN), związki siarkowe, aldehydy, ketony i estry [Parlapani i in. 2014].
Do wytwarzania wskaźników świeżości używa się zazwyczaj prostych związków chemicznych (indykatorów) zmieniających barwę pod wpływem zmiany pH. Barwniki umieszcza się w matrycy polimerowej w obecności humektantów i innych substancji pomocniczych zapewniających optymalne warunki pracy wskaźnika. Jeżeli w wyniku psucia się ryb w przestrzeni opakowania pojawiają się lotne aminy powodujące wzrost pH środowiska wskaźnika, to następuje zmiana jego barwy, która powinna być widoczna gołym okiem. Taki układ oparty na zieleni bromokrezolowej zaproponowali w swoich badaniach Pacquit i in. (2006). Wskaźnik zmieniał zabarwienie z zielonego na niebieskie, a zmiany barwy były skorelowane ze wzrostem zanieczyszczenia mikrobiologicznego (bakterie Pseudomonas spp.) w próbkach ryb [Pacquit i in. 2006, 2007]. Inny wskaźnik świeżości oparty na wykrywaniu lotnych substancji zwiększających ilość azotu NZL-A wewnątrz opakowań ryb wykorzystywał specyficzne właściwości polianiliny (PA) [Kuswandi i in. 2012a]. W wyniku reakcji filmu PA z lotnymi aminami uwalnianymi w czasie psucia ryby zmieniało się zabarwienie polimeru z zielonego na niebieskie. Zmiana była skorelowana ze wzrostem zanieczyszczenia mikrobiologicznego żywności oraz pogorszeniem jej jakości. W zdecydowanej większości przypadków jako indykatory pH stosuje się substancje syntetyczne, a jedynie w kilku pracach podjęto próbę wykorzystania w tym celu barwników pochodzenia naturalnego [Shukla 2016; Golasz, da Silva J. i da Silva S. B. 2013]. Przykładem może być zastosowanie kurkuminy we wskaźniku świeżości krewetek. Barwnik ten zmieniał swoje zabarwienie proporcjonalnie do wzrostu stężenia lotnych amin w opakowaniu oraz wzrostu zanieczyszczenia mikrobiologicznego badanej żywności [Kuswandi i in. 2012b].
W artykule zostały przedstawione badania związane z przygotowaniem i oceną skuteczności działania wskaźników świeżości opartych na barwniku syntetycznym, tj. czerwieni metylowej (MR) oraz wskaźnikach wykorzystujących naturalne barwniki spożywcze: antocyjany (An) będące ekstraktem ze skórek winogron (E163) oraz kurkuminę (Ku) (E100). Wskaźniki badano w układach modelowych i w opakowaniu obserwując ich reakcję na psujące się mięso ryb.
Materiały
Wskaźniki świeżości wykorzystane w badaniach stanowiły mieszaninę związków chemicznych rozpuszczonych w wodzie destylowanej, które po wysuszeniu przyjmowały postać filmu. Do przygotowania wskaźników wykorzystano: sól sodową karboksymetylocelulozy, glicerol (99%), czerwień metylową (MR), kwas chlorowodorowy (0,1 N roztwór HCI), etanol (96%) oraz naturalne barwniki: kurkuminę (E 100) i antocyjany, tj. ekstrakt ze skórek winogron (E163). Roztwory barwników naturalnych były świeżo przygotowane (w stosunku 1:10) z komercyjnie dostępnych roztworów barwników spożywczych i przechowywane bez dostępu światła. Czerwień metylową wprowadzano do mieszaniny wskaźnika jako 3% (w/v) roztwór podstawowy w 50% (v/v) wodnym roztworze etanolu. Wszystkie roztwory przygotowywano przy użyciu wody destylowanej.
Do formowania wskaźnika wykorzystywano okrągłe formy (o średnicy 16,2 mm) wykonane z przezroczystego, bezbarwnego polistyrenu. Formy były umiejscowione na dnie komory o pojemności ok. 100 cm3 użytej do badań modelowych z roztworami amoniaku oraz próbkami mięsa ryb. Opakowania zastosowane do badania wskaźnika świeżości w warunkach rzeczywistych posiadały pojemność 500 ml i były wykonane z orientowanego polistyrenu. Do ich zamknięcia użyto zgrzewanej folii wieczkowej PET/CPP (kompozyt poli (tereftalanu etylenu) i polipropylenu). Do badania wskaźnika w warunkach rzeczywistych wykorzystano próbki mięsa dorsza atlantyckiego – świeże filety przechowywane w trakcie transportu w lodzie.
Otrzymywanie wskaźnika świeżości
Karboksyetylocelulozę rozpuszczano w wodzie destylowanej w temperaturze 40°C do uzyskania klarownego roztworu. Następnie do mieszaniny wprowadzano humektant w postaci glicerolu, roztwór badanego barwnika – 3% (v/v) względem roztworu wyjściowego oraz w przypadku konieczności obniżenia poziomu pH mieszaniny wskaźnika 0,1 N roztwór HCl (do finalnego stężenia ok. 1 mM HCl). Udział suchej masy w roztworze wskaźnika wynosił ok. 4% (w/v). Tak otrzymaną jednorodną mieszaninę odgazowywano w łaźni ultradźwiękowej przez 1 minutę. Następnie porcję mieszaniny o objętości 0,7 ml umieszczono w formie i pozostawiono do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 20 godzin. W przypadku wykorzystania wskaźnika w opakowaniach był on umieszczany wewnątrz pojemnika bezpośrednio na powierzchni zgrzewanej folii wieczkowej w objętości 1,0 ml (pozostawiony przed zgrzaniem do wyschnięcia przez 20 godzin).
Pomiar zmian barwy
Zmiany barwy rejestrowano przez wykonanie zdjęć aparatem cyfrowym o rozdzielczości 14,7 MP w powtarzalnych warunkach oświetlenia i ustawienia obiektywu dla danej serii badań. Otrzymane zdjęcia opracowywano za pomocą programu GIMP
2.8 [The GIMP Team, 2015] uzyskując uśrednione parametry barwy w systemie RGB. Następnie za pomocą kalkulatora przestrzeni barw ColorConverter [WorkWithColor 2015] przeliczono uzyskane wyniki z systemu RGB na model L*a*b*. Na podstawie uzyskanych wyników obliczano różnicę barw wskaźników TCD (ang. Total Color Difference) za pomocą wyrażenia:
TDC = √ (DL)2 + (Da)2 + (Db)2
gdzie: DL, Da, Db – to różnice barwy w systemie L, a, b względem odniesienia.
Wyniki badań
Badania modelowe z amoniakiem
W pierwszym etapie badań sprawdzono skuteczność działania otrzymanych wskaźników w warunkach modelowych. W komorze reakcyjnej umieszczono badane wskaźniki w następującym układzie (rys. 1a): mieszaniny bez dodatku HCl po lewej stronie, mieszaniny o obniżonym pH po prawej; dodatek barwników – odpowiednio czerwieni metylowej (górny rząd wskaźników), antocyjanów (środkowy rząd) lub kurkuminy (dolny rząd). Następnie do komory wprowadzono po 0,5 ml 5% roztworu amoniaku do każdego rzędu wskaźników i obserwowano przebarwienia poszczególnych mieszanin. Pary amoniaku wykorzystano jako odpowiednik lotnych produktów rozkładu ryb i produktów rybnych. Stosunkowo wysokie stężenie roztworu amoniaku oraz znaczna prężność par tego związku zapewniają szybką reakcję badanych wskaźników i pozwalają na łatwe porównanie działania poszczególnych mieszanin. Na rys. 1b przedstawiono zmiany barwy wskaźników po 40 minutach oddziaływania z parami amoniaku.
Z kolei na rys. 2 zostały zaprezentowane wartości parametru TCD dla badanych wskaźników świeżości, bez obniżonego wyjściowego poziomu pH (rys. 2a) i z dodatkiem HCl (rys. 2b), po oddziaływaniu z parami 5% roztworu amoniaku. Parametr TCD był wyliczany w odniesieniu do barwy wskaźników bezpośrednio przed wprowadzeniem do komory roztworu amoniaku.
Z rezultatów przedstawionych na wykresach (rys. 2) wynika, że wartość parametru TCD w większości przypadków już po 1 minucie badania przekracza wartość 5, a po 20 minutach zabarwienie wskaźników praktycznie nie ulegało zmianie. Zakłada się, że wartość parametru TCD powyżej 5 odzwierciedlają zmiany w barwie dostrzegalne dla wprawnego obserwatora, natomiast powyżej wartości 12 zmiany te są widoczne gołym okiem [Nopwinyuwong i in., 2010]. Takie zachowanie wskazuje, że wszystkie badane mieszaniny mogą być stosowane jako indykatory świeżości. Wyjątek stanowi wskaźnik zawierający czerwień metylową, którego użycie wymaga obniżenia poziomu pH badanej mieszaniny.
Obniżenie wyjściowego pH wskaźnika powoduje wolniejszą reakcję, a jednocześnie uzyskuje się znacznie większe wartości parametru TCD, co jest korzystniejsze z punktu widzenia przyszłego użytkownika. W próbkach bez dodatku HCl szybko zachodzące zmiany barwy będą utrudniały ich skorelowanie z efektami związanymi z psuciem się ryb. Mimo że najwyższe wartości parametru TCD wykazują antocyjany, to jednak zmiana barwy z koloru bordo na ciemnogranatowy (prawie czarny) może ograniczać praktyczne zastosowanie takiej kompozycji w opakowaniu żywności.
Badanie wskaźników w obecności ryby
W kolejnym etapie badań sprawdzono skuteczności działania ocenianych wskaźników w obecności psującego się produktu, tj. mięsa ryby. Przygotowane wskaźniki świeżości umieszczono w komorze reakcyjnej w taki sam sposób jak w badaniach modelowych, ale tym razem wraz z próbką świeżego filetu z dorsza (próbka pozbawiona skóry, o masie 25 g). Badania prowadzono w temperaturze pokojowej. Na rys. 3 przedstawiono zmiany barwy wskaźników w zależności od czasu przechowywania ryby.
Zrealizowane uprzednio badania mikrobiologiczne, chemiczne i organoleptyczne wykazały, że zmiany w mięsie ryb (w tym stosowanych w badaniu filetach z dorsza) powodujące obniżenie ich jakości zachodzą po około 15 godzinach od rozpoczęcia przechowywania w temperaturze pokojowej. Z tego względu w ocenie działania wskaźników świeżości skupiono się na zmianie ich barwy w przedziale od 12 do 20 godzin przechowywania z badanym mięsem ryb.
Podobnie jak w wyżej prezentowanych eksperymentach badano układy o obniżonym pH, jak i bez dodatku HCl. Wskaźniki świeżości oparte na czerwieni metylowej i antocyjanach, pozbawione dodatku kwasu solnego, reagowały zbyt szybko. W czasie, w którym można oczekiwać zmian jakości przechowywanych ryb, już nie obserwowano wyraźnej zmiany ich barw. Odmienne zachowanie wykazywały wskaźniki z dodatkiem kurkuminy. Pozbawione dodatku obniżającego pH, pokazywały one zmiany zabarwienia (z żółtego na pomarańczowe), które można skorelować z pogarszającą się jakością mięsa dorsza (rys. 3a). Najlepiej sprawdzającymi się wskaźnikami na tym etapie badań okazały się mieszaniny z dodatkiem HCl zawierające naturalny indykator pH w postaci antocyjanów oraz syntetyczną czerwień metylową. W obu przypadkach wzrost parametru TCD jest stały, dochodzący do 30 jednostek i z całą pewnością zmiany w zabarwieniu widoczne są gołym okiem dla każdego obserwatora (rys. 3b). Oba wskaźniki zostały wytypowane do wykorzystania w opakowaniu z produktem spożywczym. Dodatkowo do ostatniego etapu badań wybrano wskaźnik oparty na kurkuminie, ale pozbawiony dodatku HCl.
Ocena skuteczności działania wskaźników w opakowaniu żywności
Ostatni etap badań miał na celu sprawdzenie działania wyselekcjonowanych wskaźników w obecności psującego się mięsa ryby (dorsza) umieszczonego w opakowaniu z tworzywa sztucznego. Na powierzchnię folii, która posłużyła do zamknięcia pojemnika, wylane zostały badane wskaźniki (rys. 4a). Po wprowadzeniu do opakowania próbki dorsza pojemnik zgrzano z folią i poddano przechowywaniu w temperaturze pokojowej (rys. 4b).
Na rys. 5 przedstawiono zmiany barwy wyselekcjonowanych układów pod wpływem psującego się mięsa ryby w opakowaniu. Z otrzymanych rezultatów wynika, że zmiany barwy rejestrowano w zakresie od 12 do 16-17 godzin. Były one wyraźne i wystarczające do zaobserwowania przez niewykwalifikowanego obserwatora. Przy dalszym przechowywaniu pomiar barwy wskazywał, że nie ulega ona zmianie. Wszystkie badane wskaźniki świeżości wskazywały na wyraźne pogorszenie się jakości mięsa ryby po 16 godzinach jej przechowywania, co było skorelowane ze zmianami jego wyglądu, zapachu, odczynu pH oraz z wyraźnym zwiększeniem liczebności drobnoustrojów w badanych próbkach żywności. Najwyraźniejsze zmiany barwy z czerwonej na żółtą zapewnił wskaźnik oparty na czerwieni metylowej (TCD ok. 35), jednak barwniki naturalne także wykazywały spory potencjał w ich wykorzystaniu we wskaźniku. Kurkumina przebarwiała się z barwy żółtej na pomarańczową przy TCD równym 24-25, natomiast antocyjany z fioletowej na brunatnobrązową przy TCD 15-16.
Wnioski
Z przeprowadzonych badań wynika, że do wytworzenia wskaźników świeżości mięsa ryb można wykorzystać obok barwników syntetycznych (np. czerwieni metylowej) również barwniki naturalne takie jak kurkumina i antocyjany (ekstrakt ze skórki winogron). Do właściwego skorelowania ich wskazań z procesem psucia się ryby konieczne jest jednak uzyskanie odpowiedniego pH wyjściowego składu chemicznego wskaźnika.
Otrzymane w pracy wskaźniki dają wyraźne zmiany zabarwienia, które powinny być zauważalne dla przeciętnego konsumenta.
Bibliografia
1. Cierpiszewski R. 2016, Opakowania aktywne i inteligentne, Wydawnictwo Uniwersytetu Ekonomicznego w Poznaniu, Poznań
2. Golasz L.B., da Silva J., da Silva S.B., 2013, Film with Anthocyanins as an Indicator of Chilled Pork Deterioration, Ciencia e Tecnologia de Alimentos, vol. 33 (Supl. 1), s. 155-162
3. Green K. 2014, The State of World Fisheries and Aquaculture (Sofia) 2014 – Fish Stock Status Highlights, Seafish Summary, www.seafish.org/media/publications/SeafishSummary_FAO SOFIARpt2014.pdf [dostęp: 20.12.2015]
4. Kuswandi B., Jayus, Restyanna A., Adbullah A., Heng L.Y., Ahmad M. 2012a, A Novel Colorimetric Food Package Label for Fish Spoilage Based on Polyaniline Film, Food Control, vol. 25, s. 184-189
5. Kuswandi B., Jayus, Larasati T.S., Abdullah A., Heng L.Y. 2012b, Real-time Monitoring of Shrimp Spoilage Using On-package Sticker Sensor Based on Natural Dye of Curcumin, Food Analytical Methods, vol. 5, s. 881-889
6. Kuswandi B., Jayus, Oktaviana R., Abdullah A., Heng L. Y., 2013, Novel On-Package Sticker Sensor Based on Methyl Red for Real-Time Monitoring of Broiler Chicken Cut Freshness, Packaging Technology and Science, vol. 27 (1), p. 69-81
7. Morsy M.K., Zór K., Kostesha N., Alstrøm T.S., Heiskanen A., El-Tanashi H., Sharoba A., Papkovsky D., Larsen J., Khalaf H., Jakobsen M.H., Emnéus J. 2016, Development and Validation of a Colorimetric Sensor Array for Fish Spoilage. Food Control, vol. 60, s. 346-352
8. Nopwinyuwong A., Trevanich S., Suppakul P. 2010, Development of a Novel Colorimetric Indicator Label for Monitoring Freshness of Intermediate-moisture Dessert Spoilage, Talanta, vol. 81, s. 1126-1132
9. Pacquit A., Lau K.T., McLughlin H., Frisby J., Quilty B., Diamond D. 2006, Development of a Volatile Amine Sensor for the Monitoring of Fish Spoilage, Talanta, vol. 69, s. 515-520
10. Pacquit A., Frisby J., Diamond D., Tong Lau K., Farrell A., Quilty B., Diamond D. 2007, Development of a Smart Packaging for the Monitoring of Fish Spoilage, Food Chemistry, vol. 102, s. 466-470
11. Parlapani F.F., Mallouchos A., Haroutounian S.A., Boziaris I.S. 2014, Microbiological Spoilage and Investigation of Volatile Profile During Storage of Sea Bream Fillets under Various Conditions, International Journal of Food Microbiology, vol. 189, s. 153-163
12. Ryder J., Iddya K, Ababouch L. (Eds) 2014, Assessment and Management of Seafood Safety and Quality. Current Practices and Quality. Food and Agriculture Organization of United Nations, Rome
13. Oehlenschläger J. 2014 Seafood Quality Assessment in Boziaris I.S. (Ed.) Seafood Processing IFST Advances in Food Science Series. Technology, Quality & Safety, John Wiley & Sons Ltd. West-Sussex, UK, s. 361-386
14. Shukla V., Kandeepan G., Vishnura M. V., Soni A., 2016, Anthocyanins Based Indicator Sensor for Intelligent Packaging Application, Agric. Res. 5 (2), s. 205-209
15. The GIMP Team, 2015, GNU Image Manipulation Program (GIMP), https://www.gimp.org/ [dostęp: 02.05.2015]
16. WorkWithColor, 2015, Color Converter, http://www.workwithcolor.com/color-converter-01.htm [dostęp: 02.05.2015]
Mariusz Tichoniuk, Natalia Radomska, Ryszard Cierpiszewski
Alfa-Print Sp. z o.o.
ul. Świętokrzyska 14A
00-050 Warszawa
