The results of the study showed that the addition of 15% bentonite modified by 0,5-0,8 kDa chitosan into 1,5 kDa chitosan matrixes as a carrier improves the antimicrobial activity against S. aureus, and it also reduces the activity against E. coli.
Wstęp
Wiek XXI zmienił nastawienie konsumentów oraz producentów do cech funkcjonalnych opakowań żywności. Obecnie opakowanie – poza tym, że musi być wytrzymałe, ułatwiające transport i jednocześnie zachęcające konsumenta do zakupu – powinno również spełniać funkcje dodatkowe, do uzyskania których prowadzi szereg procesów ulepszających (1-5). Dodawanie substancji aktywnych przez powlekanie jest metodą optymalną, zwłaszcza wtedy, gdy materiał bazowy opakowania ma stanowić podstawę dla różnego rodzaju modyfikacji. Substancje aktywne można podzielić na trzy grupy: substancje syntetyczne, substancje naturalne oraz probiotyki. W przypadku ich zastosowania do modyfikacji opakowań żywności wskazane jest, aby użyta substancja znajdowała się na liście dodatków do żywności – co jest szczególnie istotne w przypadku bezpośredniego kontaktu z żywnością (2). Spośród wielu substancji aktywnych mikrobiologicznie należy wyróżnić chitozan, który nie tylko działa bakteriobójczo lub bakteriostatycznie, ale również tworzy trwałe filmy, co ułatwia jego zastosowanie w opakowalnictwie żywności. Niektórzy autorzy podkreślają fakt, że skuteczność chitozanu jest uzależniona od jego masy cząsteczkowej i stężenia w badanym układzie (6,7,8); wskazują jednak, że chitozan o niższej masie cząsteczkowej ma lepsze właściwości antybakteryjne niż ten o wyższej (8-11). Na uwagę zasługuje także fakt, że stosuje się rozmaite modyfikacje chitozanu w celu zwiększenia jego skuteczności antymikrobiologicznej oraz rozszerzenia zakresu jego działania np. przez dodatek olejów/ekstraktów roślinnych (m.in. z oregano, bazylii, czosnku lub też sorbinianu potasu lub nizyny) do filmów chitozanowych (12,13). Chitozan, a zwłaszcza filmy chitozanowe są stosowane w szerokim zakresie w technologii żywności oraz opakowalnictwie żywności.
Celem badań była ocena możliwości zastosowania chitozanu jako głównego lub dodatkowego składnika powłoki naniesionej na materiał celulozowy. Modyfikacja powierzchni tektury, tj. bazowego materiału miała na celu uzyskanie właściwości antymikrobiologicznych. Podjęto próbę modyfikacji powłoki chitozanowej za pomocą glinokrzemianu. Kolejny etap obejmował kontrolę podstawowych właściwości przeciwbakteryjnych dla uzyskanych układów.
Materiał i metody
Do przeprowadzenia doświadczeń wykorzystano:
n zdegradowany chitozan o średnioliczbowej masie molowej Mn 0.5 – 0.8 kDa oraz 1,5 kDa, pochodzenia chińskiego (Yuhuan Ocean Biochemical Co., Ltd., Chiny);
n bentonit będący w ofercie firmy Zakłady Górniczo-Metalowe (ZGM) Zębiec S.;
n materiał celulozowy w postaci tektury Performa Natura (Stora Enso) o gramaturze 255 [g/m2] i grubości 350 µm;
n dwa szczepy bakteryjne Staphylococcus aureus oraz Escherichia coli pochodzące z kolekcji IIiTD we Wrocławiu;
n pożywki mikrobiologiczne MacConkey, TSB oraz TSA agar (Merck). Podłoża zostały przygotowane zgodnie z protokołem firmy.
Przed modyfikacją glinokrzemian (bentonit) był dyspergowany w wodzie, a następnie poddawany sonifikacji (sonifikator UP400S, Hielscher, Niemcy) o cyklu 0,5 i amplitudzie 50% przez 15 minut. Dodatkowo roztwór wodny bentonitu wirowano (wirówka laboratoryjna WE-2, Mechanika Precyzyjna Spółdzielnia Pracy, Polska) przez pół godziny z prędkością
2500 obr./min. Wstępne stężenie bentonitu wynosiło 5% wag., po zdekantowaniu cieczy znad osadu po wirowaniu malało do 1,2-2% wag.
Modyfikację chitozanem przeprowadzano przez równowagowe mieszanie roztworów chitozanu oraz przygotowanego uprzednio roztworu bentonitu. Bezpośrednio po zmieszaniu układ poddawano sonifikacji w celu rozbicia powstających aglomeratów powodujących znaczne zwiększenie lepkości roztworu (sonifikacja w cyklu 0,5 i amplitudzie 50%). Dodatkowo przed każdym procesem powlekania przeprowadzano homogenizację składników za pomocą homogenizatora (Heidolph Silent Crusher M) z prędkością obrotów 15 tys. obr./min w czasie 5 minut.
Jako próby odniesienia wykonano filmy z chitozanu o masie cząsteczkowej 1,5kDa, a także z modyfikowanego chitozanu, tj. chitozanu o masie cząsteczkowej 1,5 kDa zawierającego 15% bentonitu zmodyfikowanego chitozanem o masie cząsteczkowej 0,5-0,8 kDa. Następnie oba rodzaje chitozanów (czysty oraz modyfikowany – zawierający bentonit) wykorzystano do wykonania powłok na tekturę.
Powlekanie przeprowadzano za pomocą powlekarki Unicoater 409 (Erichsen, Niemcy) z użyciem wałka ryflowanego; proces prowadzono w warunkach temperatury pokojowej i wilgotności powietrza 50-60% RH. Suszenie powłok przeprowadzano w pozycji poziomej w suszarce (Binder FP115, Niemcy) z obiegiem powietrza. Temperatura suszenia wynosiła 75°C. Suszono do momentu uzyskania suchej powierzchni powłoki; czas ten wynosił do 45 min. Powleczony papier sezonowano przed kolejnymi badaniami w temperaturze pokojowej 23 +/- 2°C i wilgotności powietrza 55-65% RH. Otrzymywano powłoki o grubości warstwy mokrej 50 µm (czyli o gramaturze 3 g/m2).
W kolejnym etapie badań analizowano właściwości antymikrobiologiczne filmów chitozanowych, modyfikowanych filmów chitozanowych oraz powlekanych materiałów celulozowych względem mikroorganizmów S. aureus i E. coli. Doświadczenia przeprowadzono za pomocą metody dyfuzyjno-krążkowej, w której analizowano strefy zahamowanego wzrostu drobnoustrojów, a także z wykorzystaniem normy JIS Z 2801: 2000 „Antimicrobial products – test for antimicrobial activity and efficacy”. Próby odniesienia stanowiła niepowlekana tektura.
Wyniki i dyskusja
Na podstawie doświadczeń przeprowadzonych za pomocą metody dyfuzyjno-krążkowej stwierdzono, że zarówno w przypadku filmów chitozanowych oraz filmów chitozanowych zawierających zmodyfikowany bentonit, jak i materiałów celulozowych powlekanych czystym, a także modyfikowanym chitozanem mikroorganizmy należące do obu gatunków nie rosły bezpośrednio pod położonym krążkiem. Świadczy to o właściwościach antymikrobiologicznych zarówno powłok naniesionych na tekturę, jak i filmów. W przypadku prób odniesienia, które stanowiła niepowlekana tektura, pod krążkami zauważono wzrost zarówno E. coli, jak i S. aureus, co wyklucza potencjalny wpływ braku tlenu na brak wzrostu tlenowych komórek S. aureus. Nie stwierdzono wpływu bentonitu na właściwości antymikrobiologiczne chitozanu. Jednocześnie nie odnotowano stref zahamowanego wzrostu dla żadnej z analizowanych prób poza bezpośrednio kontaktującą się z mikroorganizmami próbką. Prawdopodobnie jest to spowodowane tym, że cząsteczki chitozanu nie dyfundują z powłoki/filmu do podłoża, ale działają miejscowo (rys. 1). Podsumowując, działanie chitozanu o masie 1,5 kDa oraz zawierającego modyfikowany chitozanem bentonit jako składnik powłoki ograniczone jest jedynie do pola kontaktu z mikroorganizmami; chitozan nie dyfunduje do podłoża, co jest spowodowane prawdopodobnie dużymi siłami adhezji łączącymi powłokę chitozanową z materiałem bazowym.
Badania przeprowadzone z wykorzystaniem metody opisywanej w normie JIS Z 2801:2000 potwierdziły właściwości antymikrobiologiczne zarówno filmów, jak i powłok chitozanowych (tab. 1, 2). W przypadku filmów wykonanych z chitozanu nie odnotowano bowiem wzrostu mikroorganizmów zarówno należących do S. aureus, jak i do E. coli (tab. 1). Mniejszą aktywnością względem tych drobnoustrojów charakteryzowały się natomiast powłoki. Zauważono bowiem, że tektura powlekana chitozanem ograniczyła wzrost komórek S. aureus z 9,416*103 cfu/mL do 8,848*103 cfu/mL (6%), a pałeczek E. coli z 11,580*103 cfu/mL do 4,044*103 cfu/mL (50,7%) w stosunku do tektury, która nie została pokryta (tab. 2). Odmienne rezultaty uzyskano dla powłoki z chitozanu zawierającego bentonit. W tym przypadku liczba komórek S. aureus spadła z 9,416*103 cfu/mL do 4,642*103 cfu/mL (65,1%), zaś ilość E. coli zmalała
z 11,580*103 cfu/mL do 7,176*103 cfu/mL (30,3%). Uzyskane wyniki świadczą o tym, że dodatek bentonitu poprawia aktywność antymikrobiologiczną chitozanu względem S. aureus, a jednocześnie pogarsza aktywność względem E. coli. Podobnie Alvares M. i in. (14) założyli, że dodatek substancji aktywnych lub modyfikacja chitozanu mogą zwiększyć jego właściwości antymikrobiologiczne. Wspomniani autorzy stwierdzili, że chitozan wykazuje takie właściwości jedynie w środowisku kwaśnym. Dlatego by zwiększyć jego aktywność względem E. coli w szerszym zakresie pH wykonywali powłoki chitozanowe z dodatkiem olejków eterycznych. Pozytywne wyniki badań potwierdziły słuszność ich założeń. W. Chen i in. (15), aby zwiększyć właściwości antymikrobiologiczne chitozanu względem Gram-ujemnych pałeczek takich jak Salmonella sp., wykorzystywał izotiocyjaniany allilowe oraz układy mieszane chitozan/nizyna/izocyjaniany allilowe. Badania tych autorów także potwierdziły, że powłoki kompozytowe mogą być bardziej skuteczne względem komórek bakteryjnych –w tym przypadku Salmonella sp. Nie wszystkie jednak modyfikacje powłok chitozanowych wpływają na właściwości antymikrobiologiczne. Niekiedy bowiem dodatek pewnych substancji nie wpływa na redukcję komórek bakteryjnych. Dowodzą tego badania takich autorów jak P. Fernandez-Saiz i in. (16), którzy do chi-tozanu dodawali białka gliadynowe. Powłoki uzyskane przez tych autorów charakteryzowały się większą odpornością na wodę niż czysty chitozan.
Wnioski
Dodatek 15% bentonitu zmodyfikowanego chitozanem o masie 0,5-0,8 kDa do chitozanu o masie cząsteczkowej około 1,5 kDa poprawia aktywność antymikrobiologiczną chitozanu względem S. aureus, a jednocześnie pogarsza aktywność względem E. coli.
Literatura
1. A. L. Brody, E. R. Strupinsky, L. R. Kline, Active packaging for food applications, Technomic Publishing Co., Lancaster, (2001) 131-194
2. J. H. Han, Antimicrobial packaging systems; Innovations in Food Packaging ISBN: 0-12-311632-5, (2005) 80-107
3. J. H. Han, Packaging for nonthermal processing of food, Blackwell Publishing, ISBN-13: 978-0-8138-1944-0, 10-52, (2007) 139-220
4. D. S. Lee, Packaging containing natural antimicrobial or antioxidative agents; Innovations in Food Packaging ISBN: 0-12-311632-5, 108-122
5. S. Aikio, S. Grönquist, L. Hakola, E. Hurme, S. Jussila, O. V. Kaukoniemi, H.
Kopola, M. Känsäkoski, M. Leinonen, S. Lippo, R. Malhberg, S. Peltonen, P. Qvinuts-Leino, T. Rajamäki, A. Ch. Ritschkoff, M. Smolander, J. Vartiainen, L. Viikari, M. Vilkman, Bioactive paper and fibre products – patent and literary survey; ESPOO 2006 VTT Working Papers 51, 1-83
6. H. K. No, N. Y. Park, S. H. Lee, H. J. Hwang, S. P. Mayers, Antibacterial activities of chitosans and chitosans olygomers with different molecular weights on spoilage bacteria isolated from tofu; Journal of Food Science: Food Microbiology and Safety 67/4, (2002) 1511-1514
7. H. K. No, N. Y. Park, S. H. Lee, S. P. Mayers, Antibacterial activities of chitosans and chitosans olygomers with different molecular weight, International Journal of Food Microbiology 74 (2002) 65-72
8. J. Rhoades, G. Gibson, K. Formentin, M. Beer, R. Rastall, Inhibition of the adhesion of enteropathogenic Escherichia coli strains to HT-29 cells in culture by chito-oligosaccharides; Carbohydrate Polymers 64 (2006) 57-59
9. D. V. Gerasimenko, I. D. Avidenko, G. E. Bannikova, O. Y. Zueva, V. P. Varlamov, Antibacterial effects of water soluble low molecular weight chitosans on different microorganisms, Applied Biochemistry and Microbiology 40/3 (2003) 253-257
10. C. Basurto, S. Chi, S. Zivancovic, P. M. Davidson, J. Weiss, Molecular weight and concentration influences antimicrobial activity of chitosan in oil-in-water emulsions; 2002, poster
11. Y. C. Chung, C. Y. Chen, Antimicrobial characteristics and activity of acidsoluble chitosan; Bioresource Technology 99 (2008) 2806-2814
12. Y. Pornato, S. K. Rakashit, V. M. Salokhe, Enhancing antimicrobial activity of chitosan films by incorporating garlic oil, potassium sorbate and nisin, LWT – Food Science and Technology 38 (2005) 859-865
13. S. Zivanovic, S. Chi, A. E. Draughon, Antimicrobial activity of chitosan films enchriched with essential oils, Journal of Food Science: Food Microbiology and Safety 70/1 (2005) 45-51
14. M. V. Alvarez, A. G. Ponce, M. del R. Moreira, Antimicrobial efficiency of chitosan coating enriched with bioactive compounds to improve the safety of fresh cut broccoli LWT
– Food Science and Technology 50 (2013) 78-87
15. W. Chen, T. Z. Jin, J. B. Gurtler, D. J. Geveke, X. Fan, Inactivation of Salmonella on whole cantaloupe by application of an antimicrobial coating containing chitosan and allyl isothiocyanate, Int J Food Microbiol. 155 (3) (2012) 165-170.
16. P. Fernandez-Saiz, J. M. Lagaron, P. Hernandez-Munoz, M. J. Ocio, Characterization of antimicrobial properties on the growth of S. aureus of novel renewable blends of gliadins and chitosan of interest in food packa-ging and coating applications. Int J Food Microbiol. 124 (1) (2008) 13-20.
