Wstęp
Z uwagi na powszechność występowania pleśni oraz ich toksycznych metabolitów mikotoksyn [1] w żywności, opakowaniach i środowisku powinna być prowadzona stała kontrola ich zawartości. Nowoczesne metody badania zawartości zarówno pleśni, jak też mikotoksyn muszą charakteryzować się wysoką wykrywalnością, precyzją, czułością oraz w miarę krótkim czasem uzyskania wyniku analizy. Badania pleśni i produkowanych przez nie mikotoksyn można prowadzić dwoma różnymi metodami analitycznymi – klasyczną biochemiczną (hodowlaną) lub chemiczną instrumentalną (tab. 1).
Metody tradycyjne polegające na hodowli pleśni na podłożach mikrobiologicznych nie zawsze pozwalają na stwierdzenie, czy w badanej próbce jest obecna grzybnia i w jakiej ilości, a przede wszystkim czy są obecne produkty jej metabolizmu – mikotoksyny. W badaniach hodowlanych wyznaczane jest najmniejsze stężenie związku hamującego wzrost pleśni MIC (ang. Minimal Inhibitory Concentration). Oznaczenie polega na przygotowaniu serii probówek z płynnym podłożem wzrostowym dla drobnoustrojów, następnie do probówek wprowadza się odpowiedni środek drobnoustrojobójczy w stężeniach malejących oraz jednakową ilość zawiesiny danej pleśni z hodowli. Po trwającej 16 do 18 godzin inkubacji w temperaturze 35°C sprawdza się, w których probówkach rozwinęły się hodowle (obserwowane jest zmętnienie, co świadczy o wzroście pleśni). Ograniczeniem metody hodowlanej jest możliwość wykrywania tylko obecności żywych, zdolnych do wzrostu komórek i stwierdzenie ewentualnego skażenia mikotoksynami.
W badaniach bezpieczeństwa żywności, opakowań oraz środowiska w zakresie skażeń mikotoksynami najkorzystniejsze są metody analizy instrumentalnej, które umożliwiają nie tylko wykrycie w analizowanej próbce obecności mikotoksyn, ich identyfikację, a także oznaczenie ilościowe na poziomie śladowym. Możliwość szybkiej identyfikacji jest bardzo istotna, ponieważ poszczególne mikotoksyny różnią się znacznie, nie tylko budową chemiczną, ale przede wszystkim toksycznością. Metody analizy mikotoksyn oparte są na właściwościach fizykochemicznych tych związków i przebiegają w następujących etapach:
n ekstrakcja z zastosowaniem odpowiedniego rozpuszczalnika (najczęściej jest to chloroform lub acetonitryl);
n oczyszczanie ekstraktów z zanieczyszczeń przeszkadzających w oznaczeniu;
n oznaczanie jakościowe i ilościowe, z wykorzystaniem właściwej techniki instrumentalnej.
Metody analityczne stosowane do oznaczania mikotoksyn
W praktyce do analizy mikotoksyn stosuje się różne metody badawcze, np. metody immunologiczne (ELISA) lub techniki chromatograficzne (cienkowarstwowa TLC, gazowa GC lub cieczowa HPLC z różną detekcją). Każda z tych metod analitycznych ma swoje zalety oraz pewne ograniczenia [3-5].
Zasada działania metody immunoenzymatycznej ELISA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) oparta jest na wybiórczym łączeniu antygenu mikotoksyny ze specyficznym przeciwciałem (reakcja antygen – przeciwciało). Powstanie barwnej pochodnej jest podstawą analizy ilościowej. Na rys. 1 przedstawiono przykładową krzywą kalibracyjną dla zearalenonu opracowaną do oznaczeń ilościowych w metodzie ELISA.
Obecnie dostępne są wygodne testy paskowe z czytnikiem umożliwiające szybkie oznaczanie ilościowe określonej mikotoksyny. Głównymi zaletami metody immunoenzymatycznej ELISA są: wysoka specyficzność, szybkość, małe zużycie rozpuszczalników, natomiast istotne ograniczenie stanowi możliwość oznaczenia tylko jednej, wcześniej wytypowanej mikotoksyny.
Dużym postępem w analizie mikotoksyn jest zastosowanie technik chromatograficznych, które umożliwiają jednoczesny rozdział mikotoksyn, ich identyfikację oraz oznaczenie ilościowe. W badaniach mikotoksyn aktualnie stosowane są:
n chromatografia cienkowarstwowa (TLC) z detektorem UV;
n chromatografia gazowa (GC) z detektorem wychwytu elektronów (ECD) lub spektrometrii mas (MS);
n wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) z detektorem UV, fluoroscencyjnym (FLD) lub spektrometrii mas (MS).
Metoda TLC stosowana jest najczęściej tylko w badaniach skriningowych, jest bowiem niedostatecznie selektywna i czuła. Na uniknięcie tych trudności pozwala zastosowanie do analizy mikotoksyn odpowiednich technik chromatograficznych (gazowej lub cieczowej). Dużym postępem w analizie mikotoksyn metodą chromatografii gazowej stało się wykorzystanie wysokorozdzielczych kolumn kapilarnych GC wraz z zastosowaniem optymalnych systemów detekcji (ECD – detektor wychwytu elektronów, MS – detektor spektrometrii mas), które pozwalają osiągnąć zadowalający poziom selektywności i czułości. Wprowadzenie drugiego detektora spektrometrii mas (tzw. tandemowa spektrometria mas GC/MS/MS) znacznie poprawiło parametry analityczne techniki GC (czułość i selektywność). Na rys. 2. przedstawiono porównanie widm mas dwóch mikotoksyn: verrucarol (VER) i trichodermol (TRID) zarejestrowanych w trybie pojedynczego kwadrupola (GC/MS) oraz w trybie podwójnego kwadrupola (GC/MS/MS) dla pochodnych TMS (trimetylosililowe) i HFB (hetpafluoromaślanowe) [6].
Pewną niedogodnością badania mikotoksyn metodą chromatografii gazowej (GC) jest konieczność przeprowadzania mikotoksyn w ich lotne pochodne w procesie tzw. derywatyzacji (np. sililacji) [7], co wydłuża czas analizy.
Ostatnio szybki rozwój przeżywa chromatografia cieczowa połączona z detekcją spektrometrii mas (HPLC-MS/MS lub w skrócie LC/MS), która zaczyna wypierać wszystkie pozostałe techniki stosowane w analizie mikotoksyn. Podstawowe zalety techniki LC/MS w zastosowaniu do analizy mikotoksyn to duża czułość i specyficzność w porównaniu do metody HPLC z inną detekcją (np. UV), w odróżnieniu od GC/MS charakteryzuje ją także znacznie mniejsza czasochłonność przygotowania próbek do analizy (nie jest konieczna derywatyzacja). Rys. 3. przedstawia typowy zestaw pomiarowy: chromatograf cieczowy (HPLC) sprzężony z detektorem spektrometrii mas (MS). Chromatografia cieczowa z detekcją MS pozwala na jednoczesną analizę pojedynczych mikotoksyn czy kilku związków, ale również mieszanin składających się nawet z kilkudziesięciu różnych substancji. Co więcej, w innych pokrewnych dziedzinach badań, np. dotyczących zanieczyszczenia żywności pestycydami, mówi się obecnie o wykrywaniu ponad 300 związków podczas jednej analizy [8]. Technika LC/MS jest metodą analityczną o potencjalnie większych możliwościach wykorzystania niż GC/MS. Chromatografia cieczowa to odpowiednia technika dla dużych, polarnych, jonowych, termicznie nietrwałych i nielotnych związków. Niektóre z tych kłopotliwych związków można adaptować do techniki chromatografii gazowej poprzez chemiczną derywatyzację, lecz jeśli nie ma odpowiednich pochodnych lub jeżeli wydajność reakcji derywatyzacji jest niska, a taka sytuacja istnieje w przypadku badania mikotoksyn, korzystniejsze jest zastosowanie chromatografii cieczowej, bezpośrednio dla mieszanin nieupochodnionych [9].

Przykłady zastosowania techniki LC/MS w badaniu mikotoksyn
W badaniach [10] wykorzystywano chromatograf cieczowy HP 1100 (firmy Hewlett-Packard) wyposażony w detektor UV z matrycą diodową (DAD) i detektor mas (MS/MS) API 3200 firmy Applied Biosystems (rys. 3.). Rozdział chromatograficzny prowadzono na kolumnie Eclipse XDB C8, 3.5 µm, 150 x 3.0 mm (produkcji Agilent Technologies). Kolumnę termostatowano w temperaturze 50°C. Jako fazę ruchomą zastosowano wodę (składnik A) i acetonitryl (składnik B). Rozdział analizowanych związków prowadzono przy zastosowaniu elucji gradientowej: od 40% A i 60% B do 0% A i 100% B w czasie 10 minut. Do rozdziału chromatograficznego stosowano wodę z aparatu Millipore Q oraz acetonitryl czystości LC-MS (produkcji J. T. Baker). Prędkość przepływu fazy ruchomej wynosiła 0.3 ml/min. Objętość dozowania próbki wynosiła 15 µl.
Detektor matrycowy UV (DAD), umieszczony liniowo pomiędzy chro
matografem cieczowym (HPLC) a detektorem spektrometrii mas (MS) włączany był na rejestrowanie widm UV w zakresie długości fal 190-350 nm.
Parametry ustawień detektora spektrometrii mas, wyposażonego w generator azotu i źródło jonów typu elektrosprej (ESI) pracujące w trybie jonów ujemnych, były następujące:
n napięcie kapilary (IS – IonSpray Voltage) wynosiło -4500 V;
n temperatura źródła jonów wynosiła 250°C;
n ciśnienie gazów: nebulizującego (GS1) 30, pomocniczego (GS2) 30, osłonowego (CUR) 10;
n parametry pracy detektora w trybie tandemowym MS/MS: CAD (ciśnienie gazu kolizyjnego) = 5.0; DP (potencjał deklasteracji) = -23.0; EP (potencjał ogniskowania) = -3.5; CE (energia zderzeniowa) = -15.0 oraz CXP (potencjał wyjściowy celi zderzeniowej) = -2.0
W opisanych warunkach analitycznych badano m.in. zawartość takich groźnych mikotoksyn jak ochratoksyna A (OTA) oraz alternariol (AOH).
Ochratoksyna A
Na rysunku 4. przedstawiono chromatogram (u góry) oraz widmo mas (poniżej) ochratoksyny A (OTA), jednej z najgroź-
niejszych mikotoksyn występujących w polskich warunkach w żywności i w opakowaniach. Zostało ono zarejestrowane w trybie MS/MS fragmentacji jonu o m/z = 402 Da, będącego jonem molekularnym pozbawionym jednego protonu [M-H]-. W analizie ilościowej ochratoksyny A wykorzystywany jest jon potomny o m/z = 358 Da, powstający z jonu m/z = 402 Da na skutek reakcji dekarboksylacji (-CO2) [11].
Alternariol
Alternariol (AOH) jest mikotoksyną wytwarzaną przez grzyby z rodzaju Alternaria. Pleśnie te szczególnie łatwo tworzą się w chłodniach i stąd duże zagrożenie, jakie stwarzają dla przemysłu spożywczego korzystającego z tego typu urządzeń.
Rys. 5. przedstawia widmo mas wzorca alternariolu zarejestrowane w trybie skan [12].
Jonem podstawowym na tym widmie jest jon o m/z = 257, będący jonem molekularnym pozbawionym jednego protonu [M - H] –. Jon o m/z = 257 poddawano w trybie MS/MS dalszej fragmentacji w komorze zderzeń (drugi kwadrupol), uzyskując widmo mas zawierające trzy bardzo charakterystyczne reakcje fragmentacji (tzw. MRM): m/z = 257/147, m/z = 257/213 oraz m/z = 257/215 (rys. 6.). Właśnie te trzy powyższe reakcje fragmentacji wykorzystywano do badania próbek na obecność alternariolu.
Podsumowanie
Pleśne oraz ich metabolity mikotoksyny wykazują wysoką odporność na większość czynników fizykochemicznych i ani gotowanie, pieczenie, ani też działanie związków chemicznych nie powoduje ich zneutralizowania lub detoksykacji. Wydaje się, że jedynym racjonalnym postępowaniem jest eliminacja żywności i opakowań do jej przechowywania, które zawierają szkodliwe mikotoksyny. Stąd też konieczny jest stały monitoring zawartości mikotoksyn w produktach spożywczych, opakowaniach, otoczeniu. Niezbędne jest również ciągłe udoskonalanie stosowanych metod analitycznych. Powinny to być metody na tyle precyzyjne, selektywne i szybkie, aby pewny wynik ilościowy był możliwy do uzyskania w ciągu kilku godzin. Najlepiej kryteria te spełnia technika LC/MS/MS, charakteryzująca się wysoką czułością i specyficznością. Pozwala ona na oznaczanie mikotoksyn z bardzo małych ilościowo próbek pobranych bezpośrednio ze środowiska (np. z otoczenia, żywności, opakowań, itp.), bez potrzeby uprzedniej hodowli pleśni. n
Literatura
[1] Bal K., A. Kaszuba. 2016. Mikotoksyny w żywności i opakowaniach do żywności – metody badań. część I. Występowanie i charakterystyka, Opakowanie 5. s. 70-72.
[2] Libudzisz Z., K. Kowal, Z. Żakowska red. 2007. Mikrobiologia Techniczna. Warszawa: Wyd. PWN.
[3] Anklam E., J. Stroka, A. Boenke. 2002. Acceptance of analytical methods for implementation of EU legislation with a focus on mycotoxins, Food Control 13. pp. 173-183.
[4] Piotrowska M., Z. Żakowska 1997. Metody oznaczania mikotoksyn, Przemysł Spożywczy 51, 12. s. 16-18.
[5] Polak-Śliwińska M., M. S. Kubiak, Z. Borejszo. 2014. Metody oznaczania wybranych mikotoksyn w żywności i paszach®, Postępy Techniki Przetwórstwa Spożywczego (2). s.120-124.
[6] Bloom E., K. Bal, E. Nyman, A. Must, L. Larsson. 2007. Optimizing a GC-MS method for screening of Stachybotrys mycotoxins in indoor environments, Journal of Environmental Monitoring 9. pp. 151-156.
[7] Filipek A., M. Daniewski, K. Bal. 2002. Oznaczanie ośmiu mikotoksyn z grupy trichotecenów metodą GCMS/MS Cz. I. Opracowanie warunków MS/MS, Roczniki PZH 53. s. 125-133.
[8] Simultaneous quantitative screening and qualitative confirmation of 300 pesticides using the new 3200 QTRAP LC/MS/MS system, Application Note, Applied Biosystems.
[9] Bloom E., K. Bal, E. Nyman, A. Must, L. Larsson. 2007. Mass Spectrometry-Based Strategy for Direct Detection and Quantification of Some Mycotoxins Produced by Stachybotrys and Aspergillus spp. In Indoor Environments, Applied and Environmental Microbiology 73. pp. 4211-4217.
[10] Bal K., W. Kalinowski. 2009. Wykrywanie skażeń mikotoksynami w próbkach środowiskowych metodą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) Część II. Warszawa: COBRO.
[11] Vartolomei A., L. Vlase, M. Cuciureanu, R. Cuciureanu, Popa D.S.2014. Determination of Ochratoxin A in Food by LC-MS/MS, Farmacia 62. pp. 287-298.
[12] Johnstone R.A.W., M.E. Rose. 2002. Mass spectrometry for chemists and biochemists, Cambridge, University Press 1996; (przekład na język polski K. Bal, M. Daniewski, polski tytuł: Spektrometria mas). Warszawa: Wyd. PWN.
