Streszczenie: Proszki uzyskane w wyniku suszenia rozpyłowego Lactobacillus rhamnosus w skali 1/4 technicznej z wykorzystaniem 4 formulacji emulsji umieszczono: a) w woreczkach z folii wysokobarierowej PET12/Al8/PE80 i zamknięto w systemie MAP o składzie 90% N2 i 10% CO2; b) w tych samych woreczkach i zamknięto w atmosferze powietrza; c) w probówkach typu falkon. Próbki przechowywano przez 12 tygodni w temp. 25°C. Zaobserwowano, że kapsułkowane mikroorganizmy były stabilne przez 4 tygodnie ich przechowywania bez względu na to, czy zostały zapakowane i w jakim systemie. Stwierdzono, że po 8 i 12 tygodniach przechowywania probiotyków najwyższą liczebność miały próbki zapakowane w systemie MAP. Najniższą przeżywalność odnotowano dla proszków, które nie zostały zapakowane. Przeprowadzone badania dowiodły, że istnieje konieczność pakowania suchych produktów spożywczych w MAP, jeśli będą one przechowywane w temperaturze pokojowej dłużej niż 12 tygodni.
Abstract: The powders obtained by ¼ technical-scale spray drying using 4 emulsions were introduced into: a) a high barier PET12/Al8/PE80 bags and packed in MAP system containing 90% of N2 i 10% CO2; b) a high barier PET12/Al8/PE80 bags and packed in air conditions; c) falcon test tubes. The samples were stored 12 weeks in 25ºC. It was demonstrated that the samples were stable after 4 weeks of storage. The viability of microorganisms did not depend on the package and packaging system. The highest viability of probiotics packed in MAP system was observed after 8 and 12 weeks of storage. The lowest viability of bacteria after the same period of storage was noticed for the samples that were introduced into falcon test tubes. The results proved that encpasulated microorganisms should be packed in MAP before 12 weeks storage in 25°C.
Wprowadzenie
Według WHO probiotyki to mikroorganizmy, które podane w liczbie nie niższej niż 107 komórek na gram produktu spożywczego wywierają pozytywny wpływ na zdrowie człowieka. Najczęściej są to bakterie należące do rodzajów Lactobacillus oraz Bifidobacterium. Mikroorganizmy te powinny utrzymywać swoją liczebność oraz aktywność w warunkach kwasu żołądkowego oraz w jelitach [1,3-9,11-12,16,18]. Niestety wiele dostępnych na rynku suplementów diety z probiotykami zawiera niższą od 107 liczbę żywych komórek w 1 g produktu, co może być spowodowane procesem przetwarzania żywności, jak również często niewłaściwymi warunkami przechowywania produktów spożywczych oraz rodzajem opakowania [7,8,12,17]. Bakterie probiotyczne dodawane są do świeżej żywności o wysokiej aktywności wody, której termin przydatności do spożycia jest liczony w tygodniach, a produkty te przechowywane są głównie w warunkach chłodniczych. Drobnoustroje mogą być dodawane także do suchych produktów spożywczych, których przydatność do spożycia jest datowana w miesiącach [12,17]. Badania wielu naukowców wykazały, że bakterie probiotyczne, suszone rozpyłowo, dodawane do produktów spożywczych wykazują wysoką przeżywalność, kiedy są przechowywane w warunkach chłodniczych. Ich przeżywalność może spadać, kiedy przechowywane są w warunkach pokojowych. Do spadku liczebności bakterii może się przyczyniać stres komórek bakteryjnych, wywołany przez suszenie rozpyłowe, dlatego podczas tego procesu wykorzystuje się wiele substancji ochronnych, zabezpieczających drobnoustroje. Negatywny wpływ na liczbę żywych komórek bakteryjnych w produkcie spożywczym ma także ich kontakt z tlenem i/lub parą wodną znajdującą się w opakowaniu [4,5,10,17]. Dlatego w przypadku, kiedy mikroorganizmy mają być przechowywane w warunkach pokojowych, istotne znaczenie ma nie tylko zastosowanie substancji ochronnych podczas suszenia rozpyłowego, ale także opakowanie i panująca w nim atmosfera.
Celem przeprowadzonych badań było sprawdzenie przeżywalności bakterii suszonych rozpyłowo w skali technicznej, z wykorzystaniem specjalnie opracowanych formulacji zawierających substancje ochronne. Porównywano liczebność bakterii pakowanych w atmosferze powietrza oraz w MAP po 12 tygodniach ich przechowywania w temperaturze 25°C.
Materiał i metody
Materiał do badań stanowiły proszki suszonego rozpyłowo szczepu Lactobacillus rhamnosus, uzyskanego z kolekcji Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej z Wrocławia. Do namnażania i hodowli mikroorganizmów wykorzystano stałą pożywkę MRS (Merck) oraz bulion MRS (Merck). Pożywki przygotowano zgodnie z protokołem firmy. Podłoża wylewano do jednorazowych płytek Petriego o średnicy 90 mm (Merck). Do przeprowadzenia doświadczeń użyto proszków zawierających komórki Lactobacillus rhamnosus IIiTD. Proszki uzyskano po wysuszeniu następujących emulsji: (1) 20% skrobia Capsul TA, 10% maltodekstryna niskoscukrzona, 5% maltodekstryna średnioscukrzona C*Dry, 8% masło kakaowe, 2% olej rzepakowy, 1% lecytyna, 6% biomasa L. rhamnosus pH 3,5; (2) 20% skrobia Capsul TA, 10% maltodekstryna niskoscukrzona, 5% maltodekstryna średnioscukrzona C*Dry, 8% masło kakaowe, 2% olej rzepakowy, 1% lecytyna, 6% biomasa L. rhamnosus pH 6,5; (3) 20% skrobia Capsul TA, 10% maltodekstryna niskoscukrzona, 5% guma arabska, 8% masło kakaowe, 2% olej rzepakowy, 1% lecytyna, 6%
biomasa L. rhamnosus pH 3,5; (4) 20% skrobia Capsul TA, 10% maltodekstryna niskoscukrzona, 5% guma arabska, 8% masło
kakaowe, 2% olej rzepakowy, 1% lecytyna, 6% biomasa L. rhamnosus pH 6,5. Koncentracje mikroorganizmów przed zapakowaniem były następujące I) 1,26 x 1010 jtk/g; II) 1,50 x 109 jtk/g; III) 4,51 x 109 jtk/g; IV) 1,88 x 109 jtk/g.
Proszki umieszczono: a) w woreczkach z folii wysokobarierowej PET12/Al8/PE80 i zamknięto w systemie modyfikowanej atmosfery (ZTP Tepro, Polska) o składzie 90% N2 i 10% CO2;
b) w tych samych woreczkach i zamknięto w atmosferze powietrza (ZTP Tepro, Polska); c) w probówkach typu falkon. Próbki przechowywano przez 12 tygodni w temperaturze 25°C. Przeżywalność bakterii badano po 0 (próba kontrolna), 1, 2, 4, 8 oraz
12 tygodniach przechowywania.
W celu sprawdzenia liczebności bakterii po przechowywaniu po 1 g proszków zawierających komórki L. rhamnosus dodawano do 9 mL bulionu MRS o pH 7,0. Wykonywano kolejne
10-krotne rozcieńczenia. Następnie 500 µL z każdego rozcieńczenia wysiewano na stałe podłoża MRS. Pożywki inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 h. Po inkubacji liczono kolonie bakteryjne, wyniki podawano w jtk/1 g proszku. Wszystkie doświadczenia wykonywano w trzech powtórzeniach. Wyniki uśredniono, obliczono odchylenia standardowe.
Morfologię wybranych kapsułek uzyskanych w wyniku suszenia rozpyłowego oraz po 12 tygodniach przechowywania analizowano za pomocą mikroskopii elektronowej SEM. Próby poddawane analizie zostały umieszczone na stolikach z taśmą węglową. Następnie nadmiar próby został zdmuchnięty sprężonym powietrzem. Tak przygotowane próby napylono złotem, stosując napylarkę ES Q150T firmy Quorum Technologies (Wielka Brytania). Napylone próby umieszczono w komorze skaningowego mikroskopu elektronowego SEM VEGA LMU (Tescan, Czechy). Do pomiaru zastosowano detektor elektronów wtórnych (SE) oraz napięcie 10 kV. Pracowano w stałej próżni.
Wyniki i dyskusja
Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że komórki L. rhamnosus, które zawieszane były w emulsji o pH 3,5
zawierającej skrobię, maltodekstrynę niskoscukrzoną, lecytynę i masło kakaowe, suszone rozpyłowo w skali ćwierćtechnicznej wykazywały wysoką przeżywalność po 1, 2 i 4 tygodniach ich przechowywania (rys. 1) w temperaturze 25°C, bez względu na to, czy zostały zapakowane, czy nie. Na ich liczebność nie miał wpływu także system pakowania. Odnotowano, że liczba żywych komórek bakteryjnych znajdowała się w tym samym log rzędzie. Uzyskane rezultaty potwierdziły skuteczność kapsułkowania bakterii. Po 8 tygodniach przechowywania próbek zaobserwowano, że liczebność mikroorganizmów znajdujących się w opakowaniach utrzymywała się na tym samym poziomie, co liczba żywych komórek po suszeniu i po 4 tygodniach ich przechowywania. Przy tym lepsze wyniki odnotowano dla proszków zapakowanych w systemie modyfikowanej atmosfery. Stwierdzono, że liczba komórek w proszkach, które nie zostały zapakowane, spadła drastycznie. Odnotowano bowiem, że ich liczba spadła z 1,26 x1010 jtk/g do 1,02 x105 jtk/g, czyli aż o 5 log. Po 12 tygodniach przechowywania próbek w warunkach pokojowych zaobserwowano większe spadki przeżywalności bakterii. Dla próbek zapakowanych w MAP liczebność komórek probiotycznych spadła do 4,62 x108 jtk/g, dla proszków pakowanych w atmosferze powietrza spadła do 1,93 x107 jtk/g, zaś dla próbek, które nie zostały zapakowane, liczba żywych komórek wynosiła tylko 4,59 x103 jtk/g.
Podobne rezultaty otrzymano dla emulsji o takim samym składzie, ale o wyższym pH = 6,5. Drobnoustroje wykazywały wysoką przeżywalność po 1 i 2 tygodniach, po 4 tygodniach ich przechowywania (rys. 2) w temperaturze 25°C, bez względu na to, czy zostały zapakowane, czy nie, zaobserwowano większe spadki żywotności. W tym przypadku również system pakowania nie miał wpływu na liczebność. Po 8 tygodniach przechowywania próbek najlepsze wyniki odnotowano dla proszków zapakowanych w systemie MAP. Stwierdzono, że liczba komórek w proszkach, które nie zostały zapakowane, spadła z 1,50 x109 jtk/g do 3,30 x107 jtk/g, czyli o ponad 2 log. Po 12 tygodniach przechowywania próbek w warunkach pokojowych zaobserwowano kolejne spadki przeżywalności bakterii. Dla próbek zapakowanych w MAP mikroorganizmy były stabilne, dla proszków pakowanych w atmosferze powietrza ich liczba spadła do 1,46 x108 jtk/g, zaś dla próbek, które nie zostały zapakowane, liczba żywych komórek wynosiła tylko 1,09 x105 jtk/g (o 4 log).
Przeprowadzone doświadczenia dowiodły, że bakterie suszone w emulsji o pH 3,5; która w swoim składzie zawierała gumę arabską zamiast maltodekstryny, również przeżywały suszenie rozpyłowe w skali ćwierćtechnicznej. Dla tego układu pierwszą redukcję liczby żywych komórek bakteryjnych zaobserwowano po dwóch tygodniach przechowywania próbek w temperaturze pokojowej (rys. 3). Liczebność komórek L. rhamnosus spadła wówczas z 4,51 x109 jtk/g do 1,74 x108 jtk/g (dla MAP); do 1,73 x108 jtk/g (dla próbek pakowanych w atmosferze powietrza); oraz do 1,52 x108 jtk/g (dla próbek przechowywanych w falkonach). Po 4 i 8 tygodniach przechowywania nie zaobserwowano dużych spadków przeżywalności. Podobnie po 12 tygodniach liczebność utrzymywała się w tym samym log rzędzie; jedynie dla próbek, których nie zapakowano, zaobserwowano spadek liczby komórek do 3,75 x107 jtk/g – zaledwie o 1 rząd logarytmiczny.
Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono, że dla emulsji IV o pH 6,5 zawierającej gumę arabską nie odnotowano spadków żywotności po pierwszych 8 tygodniach przechowywania w warunkach pokojowych. Bez względu na rodzaj opakowania bądź jego brak bakterie były stabilne. Niestety nie odnotowano wzrostu mikroorganizmów po 12 tygodniach przechowywania proszków (rys. 4).
Analiza SEM proszków po suszeniu rozpyłowym i po 12-tygodniowym okresie ich przechowywania nie wykazała różnic w morfologii kapsułek (rys. 5, 6). Nie zaobserwowano także uszkodzeń kapsułek (w postaci mikropęknięć) po całym okresie przechowywania próbek.
Mikroorganizmy, które zostały umieszczone w emulsjach przygotowanych wg 4 formulacji, zawierających w swoim składzie substancje ochronne takie jak: maltodekstryna, guma arabska czy masło kakaowe, wysuszono rozpyłowo w skali ćwierćtechnicznej. Uzyskane proszki przechowywano 12 tygodni w temperaturze 25°C. Zaobserwowano, że kapsułkowane mikroorganizmy znajdujące się w ochronnej otoczce były stabilne przez 4 tygodnie ich przechowywania bez względu na to, czy zostały zapakowane i w jakim systemie. Stwierdzono, że po 8 i 12 tygodniach przechowywania próbek najwyższą liczebność miały próbki zapakowane w barierowym opakowaniu w systemie MAP, czego dowodzi najwyższa liczba komórek bakteryjnych odnotowana dla tego układu. Zatem kapsułkowanie i pakowanie stanowiło podwójne zabezpieczenie dla komórek bakteryjnych. Substancja lipidowa chroniła komórki przed wilgocią, zaś MAP zabezpieczała probiotyki przed szkodliwym działaniem tlenu. Najniższa przeżywalność odnotowana dla proszków, które nie zostały zapakowane dowodzi, że kapsułkowanie nie stanowi wystarczającej ochrony podczas długotrwałego przechowywania immobilizowanych komórek L. rhamnosus. Na uwagę zasługuje fakt, że liczebność kapsułkowanych i pakowanych probiotyków (> 107) po 12 tygodniach przechowywania proszków utrzymywała się wciąż na poziomie wymaganym dla utrzymania funkcji prozdrowotnych. Otrzymane wyniki badań korespondują z rezultatami innych autorów. Suszone rozpyłowo mikroorganizmy mogą być dodawane do żywności, która będzie przechowywana w warunkach pokojowych. By okres przechowywania tej żywności był równy lub dłuższy od 12 tygodni, należy produkt spożywczy zapakować w systemie MAP w wysokobarierowe opakowanie. Opracowano dotychczas wiele formulacji zawierających substancje ochronne dla mikroorganizmów. S.V. Avila-Reyesa i in. [3] wykorzystali inulinę wyizolowaną z cykorii oraz skrobię natywną z ryżu do ochrony komórek L. rhamnosus podczas suszenia rozpyłowego. Proszki zawierające mikroorganizmy przechowywali 32 dni w temperaturze 4°C oraz 25°C. Autorzy stwierdzili, że lepszą przeżywalnością po przechowywaniu charakteryzowały się bakterie suszone ze skrobią niż z inuliną.
Nie odnotowano dużych różnic w liczbie żywych komórek przechowywanych w temperaturze pokojowej oraz w warunkach chłodniczych. Choć wykorzystane protektanty ochroniły drobnoustroje, spadki ich liczebności były wysokie po 32 dniach przechowywania (ponad 1 log dla mikroorganizmów przechowywanych w warunkach chłodniczych oraz ponad 2 log dla prób przechowywanych w temperaturze pokojowej). C. S. Ranad-heera i in. [15] poddali suszeniu rozpyłowemu mieszaninę szczepów Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 oraz Propionibacterium jensenii 702 zawieszonych w 20% mleku kozim. Próbki przechowywano w hermetycznych słoiczkach szklanych w temperaturze 4°C oraz 30°C przez 24 tygodnie. Badania wykazały bardzo duży spadek przeżywalności bakterii przechowywanych w temperaturze 4°C. Nie odnotowano wzrostu mikroorganizmów przechowywanych
24 tygodnie w temperaturze 30°C. Zdjęcia SEM wykazały mikropęknięcia kapsułek (proszku), co mogło spowodować osłabienie komórek, a w rezultacie ich śmierć. R. Rajam i in. [14] wykorzystali fruktooligosacharyd (FOS), izolat białka serwatkowego (WPI) oraz izolat zdenaturowanego białka serwatkowego (DWPI) do ochrony komórek L. plantarum. Badano stabilność komórek po ich przechowywaniu w warunkach chłodniczych. Autorzy stwierdzili, że najwyższy spadek przeżywalności L. plantarum po jego przechowywaniu odnotowano dla bakterii suszonych w FOS. Stwierdzono, że zawartość wilgoci oraz molekularna „mobilność” matrycy wpłynęły na spadek przeżywalności bakterii. Zaobserwowano, że bakterie były bardziej stabilne, kiedy kapsułkowano je w FOS z dodatkiem WPI oraz DWPI. J. Perdana i in. [13] analizowali przeżywalność bakterii po 60 dniach ich przechowywania w 26 i 4°C. Odnotowano, że spadek przeżywalności komórek L. plantarum był niższy dla próbek przechowywanych w temperaturze 4°C niż dla przechowywanych w 26°C. N.N. Alves i in. [2] testowali proszki zawierające mikroorganizmy przechowywane 3 tygodnie w opakowaniach polistyrenowych w temperaturze 25°C. Stwierdzili, że im wyższa była zawartość wilgoci w przechowywanych próbkach, tym wyższy był spadek liczby żywych komórek bakteryjnych. Udowodniono, że substancje ochronne, parametry procesu i temperatura przechowywania wpływają na stabilność mikroorganizmów. Równie ważny jest rodzaj opakowania oraz system pakowania [17].
Literatura
[1] Annan F., Borza A. D., Hansen L. T.: Encapsulation in alginate-coated gelatin microspheres improves survival of the probiotic Bifidobacterium adolescentis 15703T during exposure to simulated gastro-intestinal conditions., Food Res. Int., 2008, 41, 184-193
[2] Alves N. N., Messaoud G. B., Desobry S.,. Correia Costa J. M, Rodrigues S.: Effect of drying technique and feed flow rate on bacterial survival andphysicochemical properties of a non-dairy fermented probiotic juice powder, J. Food. Eng., 2016, 189, 45-54
[3] Avila-Reyesa S. V., Garcia-Suareza F. J., Jiménez M. T., Martín- Gonzalez M. F. S., Bello-Perez L. A.: Protection of L. rhamnosus by spray-drying using two prebiotics colloids to enhance the viability. Carbohyd. Polym., 2014, 102, 423-430
[4] Broeckx G., Vandenheuvel D., Claes I. J. J., Lebeer S., Kiekensa F.: Drying techniques of probiotic bacteria as an important step towards the development of novel pharmabiotics, Int. J. Pharm., 2016, 505, 303-318
[5] Dimitrellou D., Kandylis P., Petrovi T., Dimitrijevic-Brankovic S., Levic S., Nedovic V., Kourkoutas Y.: Survival of spray dried microencapsulated Lactobacillus casei ATCC 393 in simulated gastrointestinal conditions and fermented milk. Food. Sci. Technol. Int., 2016, 71, 169-174
[6] Burgain A., Gaiani C., Linder M., Scher J.: Encapsulation of probiotic living cells: From laboratory scale to industrial applications. J. Food. Eng., 2011, 104, 467-483
[7] Doherty S. B., Autya M. A., Stantona C., Rossa R. P., Fitzgerald G. F., Brodkorba A.: Survival of entrapped Lactobacillus rhamnosus GG in whey protein micro-beads during simulated ex vivo gastro-intestinal transit. Int. Dairy J., 2012, 22, 31-43
[8] Doherty S. B., Gee V. L., Ross R. P., Stanton C., Fitzgerald G. F., Brodkorb A.: Development and characterization of whey protein micro-beads as potential matrices for probiotic protection. Food Hydrocolloid., 2011, 25, 1604-1617
[9] Huang S., Cauty C., Dolivet A., Le Loir Y., Chen X. D., Schuck P., Jan G., Jeantet R.: Double use of highly concentrated sweet whey to improve the biomass production and viability of spray-dried probiotic bacteria. J. Funct. Food., 2016, 23, 453-463
[10] Iaconelli C., Lemetais G., Kechaou N., Chain F., Bermúdez- Humarán L. G., Langella P., Gervais P., Beney L.: Drying process strongly affects probiotics viability and functionalities, J. Biotechnol. 2015, 214, 17-26
[11] Laelorspoena N., Wongsasulak S., Yoovidhyaa T., Devahastin S.: Microencapsulation of Lactobacillus acidophilus in zein–alginate core–shell microcapsules via electrospraying, J. Funct. Food. 2014, 7, 342-349
[12] Mitropoulou G., Nedovic V., Goyal A., Kourkoutas Y.: Immobilization Technologies in Probiotic Food Production, J. Nutr. Met., 2013, 10, 1-15
[13] Perdana J., den Besten H. M. W., Aryani D. C., Kutahya O., Fox M. B., Kleerebezem M., Boom R. M., Schutyser M. A. I.: Inactivation of Lactobacillus plantarum WCFS1 during spray drying and storage assessed with complementary viability determination methods. Food Res. Int., 2014, 64, 212
[14] Rajam R., Anandharamakrishnan C.: Microencapsulation of Lactobacillus plantarum (MTCC 5422) with fructooligosaccharide as wall material by spray drying Food. Sci. Technol., 2015, 60, 773-780
[15] Ranadheera C. S., Evans C. A., Adams M. C., Baines S. K.: Microencapsulation of Lactobacillus acidophilus LA-5 L, Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 and Propionibacterium jensenii 702 by spray drying in goat’s milk Baines. Small. Ruminant. Res., 2015, 123, 155-159
[16] Sohail A., Turner M. S., Coombes A., Bostrom T., Bhandari B.: Survivability of probiotics encapsulated in alginate gel microbeads using a novel impining aerosols method Int. J. Food. Microbiol., 2011, 145, 162-168
[17] Tripathi M. K., Giri S. K.: Probiotic functional foods: Survival of probiotics during processing and storage, 2014, J. Funct. Food. 9, 225-241
[18] Weinbreck N. T., Bodnár I., Marco M. L.: Can encapsulation lengthen the shelf-life of probiotic bacteria in dry products? Int. J. Food. Microbiol., 2010, 136, 364-367
Katarzyna Sobecka, Małgorzata Mizielińska, Wioletta Krawczyńska, Alicja Fedorowicz, Joanna Odrzywolska, Dariusz Kiełczewski
Alfa-Print Sp. z o.o.
ul. Świętokrzyska 14A
00-050 Warszawa
