Celem pracy była analiza aktywności przeciwutleniającej folii PE oraz PLA modyfikowanych powłokami zawierającymi melaniny grzybowe. Założono, że do modyfikacji folii zostaną wykorzystane melaniny pochodzące z odpadu z produkcji pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus), ryzomorf opieńki miodowej (Armillaria mellea) oraz owocników tęgoskóra cytrynowego (Scleroderma citrinum). Jako nośniki wybrano chitozan i skrobię A4b. Oznaczano aktywność przeciwutleniającą za pomocą rodnika DPPH oraz zawartość polifenoli w powłokach za pomocą odczynnika Folina-Ciocalteau. Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono, że melaniny grzybowe mogą znaleźć zastosowanie w modyfikacji folii w kierunku nadania im właściwości przeciwutleniających. ABSTRACT: The aim of the study was evaluation of antioxidant properties of PE and PLA foils modified by coatings contaning fungal melanins. Melanins used in the study were obtained from waste from production of button mushroom (Agaricus bisporus), rhizomorphs of honey fungus (Armillaria mellea) and fruiting bodies of common earthball (Scleroderma citrinum). Chitosan and starch A4b were choosen as a coatings. Antioxidant activity of films was evaluated by DPPH and poliphenolic content by Folin-Ciocalteau’s reagent. The findings of the study point out that fungal melanins may be used in modification of foils to goal their antioxidant properties.
Wstęp
Innowacyjnym rozwiązaniem dotyczącym ochrony produktów spożywczych przed psuciem się jest stosowanie opakowań aktywnych bądź odpowiednich systemów pakowania żywności. Jednym z rozwiązań decydujących o tym, czy opakowanie zostanie zakwalifikowane do opakowań aktywnych, jest pokrywanie materiałów opakowaniowych powłokami zawierającymi substancje aktywne, m.in. antymikrobiologiczne bądź przeciwutleniające.
Przeciwutleniacze są powszechnie dodawane do produktów spożywczych w celu opóźnienia bądź zahamowania niekorzystnych zmian wynikających z procesów utleniania. Najczęściej wykorzystywanymi w przemyśle spożywczym przeciwutleniaczami są: kwas askorbinowy (E300), BHA (butylohydroksyanizol, E320), BHT (butylohydroksytoluen, E321), galusan propylu (E310) oraz tokoferole (E306-E309) [1].
Jednym z kierunków rozwoju opakowań aktywnych jest modyfikacja ich powierzchni za pomocą nośników zawierających substancje o właściwościach przeciwutleniających bądź bezpośrednie włączanie takich substancji w strukturę materiału opakowaniowego, np. folii. Duże nadzieje wiąże się z substancjami pochodzenia naturalnego. W piśmiennictwie obecne są doniesienia o modyfikacji powierzchni/struktury materiałów opakowaniowych w kierunku nadania właściwości przeciwutleniających przez zastosowanie m.in. β-karotenu, tokoferolu, olejków eterycznych, kwasu askorbinowego [1].
Melaniny to ogólna nazwa grupy wielkocząsteczkowych pigmentów odpowiedzialnych za ciemną pigmentację organizmów, powstających w wyniku oksydacyjnej polimeryzacji związków fenolowych i indolowych. Melaniny wykazują specyficzne właściwości fizykochemiczne. Wpływa na to obecność stabilnej populacji organicznych wolnych rodników o-semichinonowych, a także grup utleniających lub redukujących, np. o-chinonów oraz hydrochinonów. Dzięki temu posiadają właściwości antyutleniające, chroniące komórki przed cytotoksycznymi reaktywnymi formami tlenu (RFT) i wolnymi rodnikami takimi jak tlen singletowy, rodnik hydroksylowy oraz anionorodnik ponadtlenkowy [2]. Znalazły zastosowanie w medycynie i technologii, m.in. w tomografii optoakustycznej, w syntezie nanocząstek o właściwościach antymikrobiologicznych czy do tworzenia soczewek pochłaniających promieniowanie UV [3]. W związku z tymi właściwościami zasadna wydaje się próba ich zastosowania do modyfikacji materiałów opakowaniowych w celu nadania im właściwości przeciwutleniających.
Celem pracy była próba modyfikacji folii PE (polietylen) oraz PLA (polilaktyd) poprzez ich powlekanie nośnikami zawierającymi melaniny grzybowe w kierunku uzyskania właściwości przeciwutleniających. Założono, że do uzyskania powłok aktywnych zostaną wykorzystane: melaniny pochodzące z odpadu powstałego przy produkcji pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus), z ryzomorf opieńki miodowej (Armillaria mellea) oraz owocników tęgoskóra cytrynowego (Scleroderma citrinum).
Materiał i metody
Materiał badawczy stanowiły: odpad z produkcji pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus) w postaci trzonów owocników pozyskany z pieczarkarni na terenie Wolsztyna (województwo wielkopolskie), ryzomorfy opieńki miodowej (Armilaria mellea) oraz owocniki tęgoskóra cytrynowego (Scleroderma citrinum) zebrane w lesie mieszanym w okolicach Kobylanki (województwo zachodniopomorskie) w październiku 2016 roku.
Materiał do badań stanowiły także wytłoczone w CBiMO (Centrum Bioimmobilizacji i Innowacyjnych Materiałów Opakowaniowych) folie PE o grubości 80 µm oraz PLA o grubości 20 µm.
Wszystkie wykorzystane w badaniach odczynniki pochodziły z firmy Sigma-Aldrich.
Otrzymywanie melanin. W związku ze specyfiką materiału badawczego zastosowano dwie procedury pozyskania melanin. Odpad z produkcji A. bisporus zawiera niewiele melaniny, natomiast jest bogaty w jej prekursory oraz zawiera tyrozynazę (EC 1.14.18.1), dzięki czemu można przekształcić zawarte w odpadzie związki polifenolowe w melaninę. Ryzomorfy A. mellea oraz owocniki S. citrinum zawierają natomiast natywne melaniny.
W celu uzyskania jak największej ilości melaniny z odpadu A. bisporus jest on w pierwszej kolejności oczyszczany z resztek substratu do wzrostu wykorzystywanego w pieczarkarni oraz innych zanieczyszczeń. Następnie oczyszczony odpad homogenizowano mechanicznie (mielenie) w celu zwiększenia dostępności tyrozynazy do substratów polifenolowych, po czym inkubowano 24 h w temp. 37°C (optimum temperaturowe dla tyrozynazy) (IKA KS 4000i). Po 24 h do mieszaniny dodano 1 M NaOH do uzyskania pH=10 (w celu umożliwienia spontanicznej polimeryzacji w warunkach tlenowych pozostałych związków polifenolowych do melaniny) i inkubowano kolejne 24 h w temp. 65°C. Po okresie inkubacji mieszaninę filtrowano. Oddzielony supernatant doprowadzono do pH 2 za pomocą 1 M HCl (w celu wytrącenia melaniny). Wytrąconą melaninę odwirowywano (6000 rpm, 10 min, MPW-352R, MPW MED. INSTRUMENTS), po czym inkubowano 1 h w 6 M HCl, w cieplarce (Binder, 90°C) w celu oczyszczenia z komponentów białkowych i węglowodanowych. Osad melaniny odwirowano i oczyszczano za pomocą octanu etylu, etanolu oraz chloroformu w celu usunięcia lipidów. Oczyszczoną melaninę odwirowano i w celu usunięcia resztek rozpuszczalników umieszczono w szklanym krystalizatorze w cieplarce w temperaturze 60°C aż do całkowitego odparowania.
Ryzomorfy A. mellea oczyszczano i homogenizowano. Owocniki S. citrinum oczyszczano i pozbawiano perydrium (osłonki otaczającej owocnik). Zawartą we wnętrzu owocnika warstwę hymenialną (gleba) homogenizowano. Następne etapy postępowania były wspólne dla ryzomorf A. mellea i gleby S. citrinum. 50 g materiału umieszczano w 200 ml 1 M NaOH, po czym ekstrahowano melaniny w wytrząsarce (200 rpm, 50°C, 24 h). Po tym czasie mieszaninę filtrowano. Supernatant zakwaszano do pH=2 za pomocą 1 M HCl. Kolejne etapy postępowania były identyczne jak w przypadku oczyszczania melaniny z odpadu A. bisporus.
Przygotowanie układów powłokotwórczych oraz nanoszenie powłok. Przygotowano 18 układów powłokotwórczych zawierających melaniny oraz 6 układów kontrolnych. Jako nośniki wybrano: chitozan (Zhejiang Golden-Shell Pharmaceutical CO. Ltd., Chiny) oraz skrobię hydroksypropylowaną A4b (Dow, USA).
Melaniny otrzymane z odpadu A. bisporus, ryzomorf A. mellea oraz owocników S. citrinum oznaczono odpowiednio: „Ab”, „R”, „Sc”. Każdą melaninę rozpuszczono w DMSO (dimetylosulfotlenku) do uzyskania stężenia 5 mg/ml.
W celu wytworzenia powłoki na bazie chitozanu (CH) do 1% roztworu kwasu mlekowego w wodzie dodano chitozan do uzyskania stężenia 2%. Całość mieszano za pomocą mieszadła magnetycznego (Ika) z prędkością 600 rpm przez 24 h.
W celu uzyskania powłoki na bazie skrobi (SK) przeprowadzono proces kleikowania. 8% wodny roztwór skrobi A4b umieszczono w łaźni wodnej (Julabo) i podgrzewano do 90°C jednocześnie mieszając za pomocą mieszadła mechanicznego (400 rpm, IkaT18 Ultra Turrax). Roztwór inkubowano w łaźni przez 30 min w celu dokładnego skleikowania i uzyskania jednorodnego roztworu.
Układy powłokotwórcze przygotowano w ten sposób, że do 10 ml roztworów nośników dodawano odpowiednio 200 µl, 500 µl, 1000 µl roztworów melanin w DMSO, tak aby uzyskać stężenia: (1) 100 µg/ml, (2) 250 µg/ml, (3) 500 µg/ml. Po dodaniu melaniny roztwory dokładnie worteksowano. Przygotowano również układy kontrolne (K), do których dodano DMSO bez melanin, odpowiednio 200 µl, 500 µl, 1000 µl. Przygotowane układy powłokotwórcze ilustruje tab. 1.
Folie przed procesem powlekania poddano aktywacji koronowej. Folie powlekano za pomocą powlekarki (Unicoater 409, Erichsen, Niemcy) z wykorzystaniem wałka o średnicy drutu 0,76 mm i grubości warstwy osadzanej 60 µm. Następnie arkusze folii były suszone w cieplarce (Binder) przez 20 minut w temperaturze 45°C.
Oznaczanie właściwości przeciwutleniających folii. Do oznaczenia właściwości przeciwutleniających folii posłużono się metodą z użyciem syntetycznego rodnika DPPH (1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl) [4,5,6]. 3 ml roztworu powlekającego (RP) mieszano z 1 ml 1mM roztworu rodnika DPPH w metanolu. Następnie mieszaninę worteksowano i inkubowano w ciemności, w temperaturze 25°C przez 30 minut. Po okresie inkubacji absorbancję roztworu oznaczano spektrofotometrycznie (Evolution 220, Thermo Scientific) przy długości fali 517 nm. Każdego pomiaru dokonano w trzech powtórzeniach, wyniki uśredniono. Procentową wartość właściwości przeciwutleniających roztworów powlekających obliczano z wzoru:
%inhibicji DPPH = AbsDPPH – AbsRP x 100%
AbsDPPH
gdzie: AbsDPPH – wartość absorbancji 1mM roztworu DPPH w metanolu przy długości fali 517 nm, AbsRP – wartość absorbancji roztworu powlekającego przy długości fali 517 nm.
Oznaczenie zawartości polifenoli w powłokach. W celu oznaczenia zawartości polifenoli w powłokach z każdej folii wycięto 10 kwadratów o powierzchni 1 cm2. Kwadraty umieszczono w probówkach typu Falcon, do których dodano 2,4 ml wody destylowanej oraz 0,15 ml odczynnika Folina-Ciocalteau. Mieszaninę inkubowano 8 minut w temperaturze 25°C, po czym dodawano 0,45 ml nasyconego roztworu Na2CO3. Całość inkubowano w temp. 40°C przez 30 minut w ciemności. Po tym czasie mierzono spektrofotometrycznie (Evolution 220, Thermo Scientific) wartość absorbancji roztworu przy długości fali 765 nm [4]. Pomiaru dokonano 3 razy, a wyniki uśredniono. Przygotowano roztwór kalibracyjny kwasu galusowego w metanolu. Zawartość polifenoli w powłokach wyrażono w przeliczeniu na µg kwasu galusowego zawarte w 1 cm2 folii, korzystając z równania krzywej kalibracyjnej (y = 1,1672x + 0,0053, R2 = 0,9985).
Wyniki i dyskusja
Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono, że dodatek melanin grzybowych do powłok nanoszonych na powierzchnię folii PE oraz PLA pozwala nadać im właściwości przeciwutleniające.
Folie PE przed powlekaniem poddano procesowi aktywacji koronowej, procesowi technologicznemu, w wyniku którego otrzymuje się powierzchnie zwilżalne farbami drukarskimi, klejami oraz mieszankami powlekającymi. Powierzchnię folii PE charakteryzuje stosunkowo niska energia powierzchniowa i dopiero aktywacja umożliwia drukowanie, klejenie czy powlekanie [5].
W piśmiennictwie można znaleźć wiele przykładów modyfikacji folii PE i PLA. Trzcińska i wsp. [5] modyfikowali folie polietylenowe powłoką z chitozanu, w której immobilizowano galusan propylu, dzięki czemu uzyskano powłokę o właściwościach przeciwutleniających. Kwiatkowski i wsp. [7] modyfikowali powierzchnię folii PLA powłokami z etylocelulozy zawierającymi olejki eteryczne z fenkułu, rozmarynu i kminku, natomiast Łopusiewicz i Mizielińska [8] modyfikowali powierzchnię folii PLA powłokami z etylocelulozy i antymikrobiologicznego ekstraktu z grzyba Macrolepiota konradii.
W celu określenia właściwości przeciwutleniających powłok posłużono się metodą z użyciem syntetycznego rodnika DPPH. DPPH jest stabilnym wolnym rodnikiem i ma niesparowany elektron na powłoce walencyjnej na jednym z atomów azotu tworzących mostek azowy. Jego alkoholowy roztwór ma ciemnofioletową barwę. W reakcji z substancją, która może być donorem atomu wodoru, DPPH tworzy żółtą formę zredukowaną; wówczas zanika ciemnofioletowe zabarwienie, a zmiany te można monitorować spektrofotometrycznie. Stopień zmiany barwy roztworu DPPH po dodaniu roztworu zawierającego substancje przeciw-
utleniające jest miarą ich zdolności do zmiatania wolnych rodników [4,5,6]. Odnotowano, że wszystkie modyfikowane folie – zarówno PE, jak i PLA – wykazywały właściwości przeciwutleniające. Wśród powłok na foliach PE (tab. 2) najwyższą wartość inhibicji rodnika DPPH zaobserwowano w przypadku folii PE-CHSc3 (25,49±0,07%); była to również najwyższa wartość wśród wszystkich powłok z chitozanu na foliach PE, najmniejszą zaś wartość odnotowano dla folii PE-CHAb1 (8,61±0,08%). Wśród powłok ze skrobi A4b największą zdolnością do inhibicji rodnika DPPH charakteryzowała się folia PE-SKR3 (23,28±0,04%), najmniejszą PE-SKR1 (12,36±0,06%). Wśród powłok chitozanowych na foliach PLA (tab. 2) najwyższą wartość inhibicji rodnika DPPH zanotowano dla folii PLA-CHSc3 (25,49±0,14%), najniższą dla folii PLA-CHAb1 (8,62±0,04%). Na powłokach ze skrobi A4b najwyższą wartość zaobserwowano dla folii PLA-SKR3 (23,28±0,07%), najmniejszą zaś dla PLA-SKR1 (12,46±0,01%). Mehdizadeh i wsp. [4] dodawali do kompozytowych folii skrobiowo-chitozanowych olejek eteryczny z rośliny Thymus kotschyanus. Uzyskane przez nich folie charakteryzowały się nie tylko właściwościami przeciwutleniającymi, ale także antybakteryjnymi. Dodatek 0,50% olejku eterycznego do roztworu filmotwórczego pozwalał uzyskać inhibicję rodnika DPPH na poziomie ok. 17%, natomiast 2% dodatek olejku powodował ok. 40% redukcję rodnika DPPH. Mikusanti i Masril [6] dodawali olejek imbirowy do folii ze skrobi uzyskanej z pochrzynu skrzydlatego (Dioscorea alata). Dodatek 0,5% olejku do folii powodował 5,68% redukcję rodnika DPPH, natomiast dodatek 3% o 31,5%. Należy zwrócić uwagę, że udział melanin w najwyższym stężeniu wykorzystanym w badaniach własnych wynosi 0,05% roztworów powlekających, przy którym uzyskano inhibicję rodnika DPPH na poziomie 25,49%.
Powłoki chitozanowe i skrobiowe, do których nie dodano melanin, również charakteryzowały się właściwościami przeciwutleniającymi, jednakże znacznie mniejszymi w porównaniu z powłokami zawierającymi melaniny. Wynika to z faktu, że wolne rodniki DPPH mogą reagować z grupami aminowymi (NH2) chitozanu, tworząc formę zredukowaną, grupy aminowe zaś, przyjmując atom wodoru, mogą tworzyć jony amonowe (NH3+). Podobnie w przypadku skrobi: wolne rodniki DPPH mogą reagować z grupami hydroksylowymi (-OH), które w wyniku przyłączenia atomu wodoru tworzą grupę (OH2+) [4,6].
W celu oznaczenia zawartości polifenoli w powłokach posłużono się metodą Folina-Ciocalteau. Podstawą oznaczania jest odwracalna reakcja redukcji przez fenole w środowisku alkalicznym molibdenu (VI) do molibdenu (V) zawartego w odczynniku Folina-Ciocalteau. W wyniku reakcji powstaje niebieski związek, który wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali 765 nm. Intensywność absorpcji przy tej długości fali jest proporcjonalna do stężenia związków fenolowych w badanej próbie. Melaniny zawierają w swojej budowie grupy fenolowe [3]. W badaniach własnych za pomocą metody Folina-Ciocalteau oznaczono zawartość polifenoli przypadającą na 1 cm2 powłok na foliach PE i PLA. Zaobserwowano, że w przypadku powłok chitozanowych i skrobiowych wraz ze wzrastającym stężeniem melanin w roztworze powłokotwórczym wzrastała zawartość polifenoli na 1 cm2 powłok. Najwyższą zawartość polifenoli wśród folii PE (tab. 2) odnotowano w przypadku folii PE-CHSc3 (9,22±0,05 µg/cm2), dla folii tej uzyskano również najwyższy stopień inhibicji rodnika DPPH. Podobnie najwyższą zawartość polifenoli (9,23±0,10 µg/cm2) wśród folii PLA (tab. 2) odnotowano w przypadku folii PLA-CHSc3. Folie pokryte jedynie nośnikami bez melanin również dały dodatni wynik na polifenole w powłoce. Wynika to najprawdopodobniej z faktu, że zarówno chitozan, jak i skrobia zawierają w cząsteczkach grupy -OH, które mogą powodować interferencje w uzyskanym wyniku [4,6].
W celu nadania właściwości przeciwutleniających powłokom nanoszonym na folie wykorzystano melaniny pozyskane z grzybów: odpadu powstającego przy produkcji A. bisporus, ryzomorf A. mellea oraz owocników S. citrinum. Melaniny pełnią istotną funkcję w fizjologii grzybów. Przyjmuje się, że – jako metabolity wtórne – nie są one niezbędne dla wzrostu i rozwoju komórek grzybowych, ale stanowią ich swoisty „system obronny”. Wpływ obecności melanin na zwiększenie zdolności przeżywania grzybów w niekorzystnych dla nich warunkach wynika głównie z pełnionej przez nie funkcji zewnątrzkomórkowego układu buforowego, neutralizującego czynniki utleniające [9]. Chronią komórki grzybów przed niekorzystnym działaniem promieniowania UV, promieniowaniem jonizującym oraz wolnymi rodnikami, mogącymi uszkadzać komórki i zawarty w nich materiał genetyczny. Odgrywają również istotną rolę w patogenezie niektórych gatunków grzybów patogenicznych dla roślin i zwierząt, wpływając m.in. immunomodulująco na organizm gospodarza lub wzmacniając struktury uczestniczące w tkanki roślinne (appresoria). Mogą być syntetyzowane w różnych szlakach metabolicznych: szlaku DHN (1,8-dihydroksynaftalen) lub szlaku L-DOPA (3,4-dihydroksyfenyloalanina). Melaniny powstałe w szlaku DHN zawierają tylko węgiel oraz tlen, natomiast melaniny powstałe w szlaku L-DOPA zwierają również azot. W strukturze melanin mogą być także obecne komponenty białkowe, węglowodanowe oraz jony; stąd wynikają ich różnorodność i niekiedy odmienne właściwości [10]. Melaniny obecne są w komórkach grzybów w postaci granul (np. u Aureobasidium pullulans [11]), mogą być wbudowane w ścianę komórkową (w jej zewnętrzną lub wewnętrzną stronę, np. u Cryptococcus neoformans, zarodnikach np. Aspergillus, A. bisporus [9,12]) lub zewnętrzne warstwy struktur ponadkomórkowych (np. w ryzomorfach A. mellea) [13].
Podsumowując, należy zauważyć, że melaniny grzybowe mogą być wykorzystane w celu modyfikacji folii z polimerów syntetycznych (PE) i naturalnych (PLA) w kierunku nadania im właściwości przeciwutleniających. Właściwości te zależą nie tylko od źródła pochodzenia melanin, ale również od nośników wykorzystanych do tworzenia powłok. Wzrastające stężenie melanin w roztworach powłokotwórczych powoduje wzrost właściwości przeciwutleniających. W przypadku zarówno powłok z chitozanu, jak i ze skrobi zaobserwowano zależność pomiędzy wzrastającą zawartością polifenoli a wzrastającymi właściwościami przeciwutleniającymi.
Wnioski
Melaniny grzybowe mogą znaleźć zastosowanie w modyfikacji folii w kierunku nadania im właściwości przeciwutleniających.
AUTORZY: Łukasz Łopusiewicz, Sławomir Lisiecki, Małgorzata Mizielińska
Centrum Bioimmobilizacji i Innowacyjnych Materiałów Opakowaniowych, Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie
Literatura:
[1] Brody A., Strupinsky E., Kline L. 2001. Active Packaging for Food Applications
[2] Różanowska M., Sarna T., Land E., Truscott G., 1999. Free radical scavening properties of melanin interaction of eu- and pheo-melanin models with reducing and oxidising radicals. Free Radical Biology & Medicine 26, 518-525
[3] Łopusiewicz Ł., Lisiecki S., 2016. “Czarne złoto”- melaniny w życiu człowieka. Kosmos Problemy Nauk Biologicznych 65, 4(313), 621-629
[4] Mehdizadeh T., Tajik H., Rohani S.M.R., Oromiehie A.R., 2012. Antibacterial, antioxidant and optical properties of edible starch-chitosan composite film containing Thymus kotschyanus essential oil. Veterinary Research Forum 3(3), 167-173
[5] Trzcińska M., Sieliwanowicz B., Hałasińska A., Czupryński B., 2007. Application of physiochemically modified polymeric foil to develop antioxidant packaging. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences 57(2), 173-176
[6] Mikusanti H., Masril K.I. 2013. Antibacterial and Antioxidant of Uwi (Dioscorea alata L) Starch Edible Film Incorporated with Ginger Essential Oil. International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics 3(4), 354-356
[7] Kwiatkowski P., Giedrys-Kalemba S., Mizielińska M., Bartkowiak A. 2016. Modification of PLA foil surface by ethylcellulose and essential oils. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 5(5), 440-444
[8] Łopusiewicz Ł., Mizielińska M. 2016. Aktywność antymikrobiologiczna folii PLA powlekanych ekstraktami z Macrolepiota konradii. Opakowanie 4, 57-60
[9] Goncalvez R., Pombeiro-Sponchiado S.R., 2005. Antioxidant activity of the melanin pigment extracted from Aspergillus nidulans. Biological and Pharmaceutical Bulletin 28, 1129-1131
[10] Eisenman H., Casadevall A. 2011. Synthesis and assembly of fungal melanin. Appl Microbiol Biotechnol 93(3), 931-40
[11] Gniewosz M., Duszkiewicz-Reinhard 2008. Comparative studies on pullulan synthesis, melanin synthesis and morphology of white mutant Aureobasidium pullulans B-1 and parent strain A.p.-3. Carbohydrate Polymers 72, 431-438
[12] Wang Y., Casadevall A., 1994. Decreased susceptibility of melanized Cryptococcus neoformans to UV light. Applied Environmental Microbiology 60, 3865-3866
[13] Rigling D., Grünthardt-Goerg M., Blaustein H., Frey B. 2006. Accumulation of heavy metals into Armillaria rhizomorphs from contaminated soils. For. Snow Landsc. Res. 80 (2), 213-220
Alfa-Print Sp. z o.o.
ul. Świętokrzyska 14A
00-050 Warszawa
