Wstęp
Innowacyjnym rozwiązaniem dotyczącym ochrony produktów spożywczych przed psuciem się jest stosowanie opakowań aktywnych bądź odpowiednich systemów pakowania żywności. Jednym z rozwiązań decydujących o tym, czy opakowanie zostanie zakwalifikowane do opakowań aktywnych, jest pokrywanie materiałów opakowaniowych powłokami zawierającymi substancje aktywne, które działają bakteriobójczo na bakterie powodujące zatrucia pokarmowe, m.in.: Escherichia coli 0157:H7, Salmonella Typhimurum oraz Listeria monocygotenes. Obecnie najczęściej wykorzystywanymi w opakowalnictwie związkami aktywnymi są: bakteriocyny, ekstrakty z przypraw, olejki eteryczne, enzymy oraz kwasy organiczne [1].
Celem pracy była analiza właściwości antymikrobiologicznych Macrolepiota konradii. Ponadto podjęto próbę modyfikacji folii PLA (polilaktyd) przez jej powlekanie w kierunku uzyskania właściwości antybakteryjnych. Założono, że do uzyskania powłoki aktywnej zostaną wykorzystane substancje aktywne produkowane przez czubajkę gwiaździstą.
Materiał i metody
Materiał badawczy stanowił szczep czubajki gwiaździstej (Macrolepiota konradii), zebrany we wrześniu 2013 roku w lesie mieszanym w okolicach Kobylanki. Do przeprowadzenia doświadczeń wykorzystano także inne mikroorganizmy: Escherichia coli DSMZ 1576, Staphylococcus aureus DSMZ 346, Micrococcus luteus DSMZ 20729 oraz Bacillus athrophaeus DSMZ 675 IZT. Pochodziły one z Niemieckiej Kolekcji Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
Podczas doświadczeń wykorzystano pożywki stałe oraz buliony z firmy Merck (Mueller-Hintona, PDA), a także pochodzące z firmy Sigma Aldrich odczynniki chemiczne: etylocelulozę, glukozę, MgSO4x7H2O, K2HPO4, skrobię rozpuszczalną, chloroform, aceton, octan etylu oraz roztwór DMSO (dimetylosulfotlenku). Pożywki zostały wykonane zgodnie z protokołem firmy Merck.
Materiał do badań stanowiła także wytłoczona w CBIMO folia PLA.
W celu wyizolowania szczepu czubajki z jej owocników sterylną ezą pobierano skrawki trzonu z kawałkiem grzybni, po czym umieszczano je na szalkach Petriego z podłożem PDA z dodatkiem chloramfenikolu o stężeniu 50 mg/l. Szalki zaklejano parafilmem i inkubowano w cieplarce w temperaturze 25°C do momentu widocznego wzrostu grzybni. Następnie strzępki grzybni były przenoszone w sposób jałowy na nowe podłoże. Przed założeniem hodowli płynnych grzyby były przesiewane na szalki z podłożem PDA bez dodatku antybiotyku. Następnie 250 ml bulionów w kolbach o objętości 500 ml zaszczepiano porośniętymi grzybnią skrawkami podłoża o rozmiarach 1x1 cm i inkubowano przez 3 tygodnie w wytrząsarce (IKA KS 4000) w temperaturze 25°C i przy obrotach 150 rpm. Próbę kontrolną stanowiło czyste podłoże hodowlane.
Po 3 tygodniach inkubacji hodowle były przefiltrowywane przez sączki filtracyjne (o średnicy porów 0,2 µm). Następnie pobierano 25 ml z uzyskanych filtratów, przenoszono je do probówek typu Falcon o pojemności 50 ml, po czym dodawano 25 ml płynu ekstrakcyjnego o składzie chloroform: aceton: octan etylu w stosunku objętościowym 3:2:1, a następnie umieszczano je w celu zwiększenia wydajności ekstrakcji na 1 godzinę w wytrząsarce (IKA KS 4000) przy obrotach 300 rpm. Po tym czasie probówki odstawiano w celu rozdzielenia się faz. Dolną stanowił octan etylu, górną mieszanina chloroformu i acetonu. Obie fazy były rozdzielane i w sposób sterylny za pomocą pipety przenoszone do oddzielnych probówek. W celu usunięcia z nich rozpuszczalników ekstrakty umieszczono w szklanych krystalizatorach o znanej masie w cieplarce w temperaturze 60°C aż do całkowitego ich odparowania. W celu uzyskania płynnych ekstraktów dodano do pozostałości na dnie krystalizatora 1% roztwór DMSO (dimetylosulfotlenek) do uzyskania stężenia 200 mg/ml, po czym umieszczano je na pół godziny w wytrząsarce, w temperaturze pokojowej i obrotach 100 rpm, w celu rozpuszczenia ekstraktu. Jednakową procedurę powtarzano dla czystego podłoża hodowlanego.
Aby wykazać zdolność badanego szczepu do hamowania wzrostu bakterii, posłużono się metodą dołkową. Do przeprowadzenia doświadczeń użyto podłoża Mueller-Hintona. Bakterie zawieszano w soli fizjologicznej do uzyskania koncentracji 5 w skali McFarlanda. Po wyjałowieniu i wystygnięciu podłoży do temperatury ok. 40°C dodawano 200 µl zawiesiny komórek bakteryjnych badanych szczepów. Pożywki worteksowano, następnie wylewano na szalki Petriego o średnicy 90 mm. Po zastygnięciu pożywki wycinano w niej jałowym tipsem 3 dołki o średnicy
8 mm. Do dołków nakładano 150 µl roztworu danego ekstraktu o stężeniu 200 mg/ml i umieszczano na 2 godziny w temperaturze 4°C w celu jego dyfuzji do pożywki. Próbę kontrolną stanowiły ekstrakty z czystego podłoża hodowlanego oraz roztwór chloramfenikolu o stężeniu 0,05 mg/ml. Po dwóch godzinach szalki przenoszono do cieplarki i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu oceniano obecność i rozmiar stref zahamowanego wzrostu bakterii.
Do oznaczenia minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii (MIC) wykorzystano bakterie S. aureus i E. coli. Dla każdego gatunku przygotowano 10 jałowych probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Do każdej wprowadzono wyjściowy roztwór ekstraktu o stężeniu 200 mg/ml w ilości odpowiednio 2,5 µl, 25 µl, 50 µl, 125 µl, 175 µl, 250 µl, 300 µl, 375 µl. Następnie probówki umieszczano w cieplarce w temp. 50°C, aż do odparowania rozpuszczalnika. Po tym do każdej probówki dodawano w sposób jałowy 450 µl bulionu Mueller-Hintona i worteksowano aż do rozpuszczenia ekstraktu. Następnie dodawano 50 µl zawiesiny poszczególnych gatunków bakterii o koncentracji 0,5 w skali McFarlanda (1,5x108 cfu/ml), dzięki czemu uzyskano objętość 500 µl i końcowe stężenia ekstraktów odpowiednio:
1 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 50 mg/ml, 70 mg/ml, 100 mg/ml, 120 mg/ml, 150 mg/ml. Kontrolę stanowiły probówki bez dodatku ekstraktu (450 µl podłoża + 50 µl zawiesiny bakterii). Probówki umieszczono na 24 godziny w cieplarce o temp. 37°C. Po tym czasie przygotowywano serię rozcieńczeń dziesiętnych dla każdego stężenia ekstraktu (w trzech powtórzeniach), a następnie próby wysiewano na szalki z podłożem Mueller-Hintona. Szalki były umieszczane na kolejne 24 godziny w cieplarce w temp. 37°C. Po tym czasie liczono ilość kolonii i porównywano ją z próbami kontrolnymi.
W celu modyfikacji powierzchni folii PLA przygotowano 20 ml 10% roztworu etylocelulozy w 96% alkoholu etylowym. Roztwór umieszczono na mieszadle magnetycznym na 24 h w celu dokładnego rozpuszczenia się składnika. Po tym czasie uzyskany roztwór podzielono na dwie części po 10 ml. Do jednej dodano odpowiednią ilość ekstraktu do uzyskania stężenia 20%. Następnie przygotowano 3 arkusze folii. Jeden arkusz (czysta folia PLA) stanowił próbę kontrolną, drugi został pokryty 10% etylocelulozą, a trzeci nośnikiem zawierającym ekstrakt chloroformowo-acetonowy z czubajki gwiaździstej o stężeniu 200 mg/ml. Folie powlekano za pomocą powlekarki (Unicoater 409, Erichsen, Niemcy) z wykorzystaniem wałka o średnicy drutu 1,27 mm i grubości warstwy osadzanej 100 µm. Następnie arkusze były suszone przez 20 minut w temperaturze 45°C.
Do sprawdzenia właściwości antybakteryjnych powlekanych folii PLA wykorzystano wzorcową metodę badawczą służącą do określania aktywności czynnika antybakteryjnego włączonego w polimerowe lub hydrofobowe materiały, oznaczoną normą ASTM E 2180-01 [2]. Metoda ta umożliwia ocenę właściwości antybakteryjnych warstwy zawierającej czynnik antybakteryjny, związanej na powierzchni modyfikowanej folii PLA oraz test dyfuzji czynnika antybakteryjnego z folii do podłoża stałego i jego wpływu na wzrost drobnoustrojów wzorcowych za pomocą metody dyfuzyjno-krążkowej.
Wyniki i dyskusja
Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono, że badany szc
zep czubajki gwiaździstej wykazał zdolność do hamowania wzrostu bakterii. Ekstrakty chloroformowo-acetonowe (ChA) z płynu pofermentacyjnego charakteryzowały się dużą aktywnością antymikrobiologiczną. Hamowały bowiem wzrost zarówno bakterii Gram dodatnich (S. aureus, M. luteus), jak i Gram ujemnych (E. coli). Nie ograniczyły natomiast wzrostu B. atrhophaeus. Ekstrakty z fazy dolnej (octan etylu) oraz próby kontrolnej (czysty płyn pofermentacyjny) nie wykazywały aktywności względem wymienionych drobnoustrojów. Roztwór o stężeniu 200 mg/ml spowodował powstanie odpowiednich stref zahamowanego wzrostu bakterii (tab. 1).
W celu określenia minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii (MIC) wybrano dwa gatunki drobnoustrojów, tj. E. coli oraz S. aureus. Uzyskane wyniki stabelaryzowano (tab. 2). Na
podstawie przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono, że badany ekstrakt istotnie wpływał na przeżywalność komórek bakteryjnych. Odnotowano, że w przypadku pałeczek E. coli 50 mg ekstraktu w 1 ml bulionu doprowadziło do ograniczenia wzrostu tych bakterii o cztery logarytmiczne rzędy w stosunku do próby kontrolnej. Taka sama ilość ekstraktu obniżyła ilość komórek S. aureus o trzy logarytmiczne rzędy. Dopiero 100 mg/ml okazało się stężeniem, które zredukowało liczbę komórek gronkowca złocistego o cztery rzędy. Zatem bardziej wrażliwa na działanie ekstraktu była E. coli. Uzyskane rezultaty pozwoliły także na stwierdzenie, że stężenie ekstraktu równe 150 mg/ml w przypadku pałeczek oraz 120 mg/ml w przypadku ziarniaków ograniczyło wzrost analizowanych bakterii o 5 rzędów logarytmicznych. Wyższe stężenia substancji aktywnych nie powodowały większego spadku komórek mikroorganizmów dla obu omawianych gatunków (tab. 2).
Niestety niewiele jest pozycji literaturowych dotyczących właściwości antymikrobiologicznych czubajek (Macrolepiota). Zespół Dulgera i wsp. [3] wykazał właściwości antymikrobio-
logiczne trzech gatunków czubajek: Macrolepiota rachodes, M. heimii oraz M. puellaris. Autorzy badali etanolowe ekstrakty z owocników. Działały one na szerokie spektrum bakterii (13 gatunków) oraz drożdży (3 gatunki), w tym gatunki takie jak: E. coli, S. aureus, M. luteus, B. cereus, B. subtilis oraz Candida albicans. W innych badaniach zespół Dulgera [4] wykazał właściwości antymikrobiologiczne czubajki kani (M. procera) wobec szerokiego spektrum bakterii Gram dodatnich i Gram ujemnych oraz drożdży, a szczególnie wobec gatunków takich jak: Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes, Candida utilis oraz Hansenula sp. Inni autorzy również donoszą o właściwościach antymikrobiologicznych czubajki kani, np. Alves i wsp. [5], którzy wykryli w niej szereg związków fenolowych, np. kwas protokatechowy, kw. kawowy, kw. ferulowy, kw. wanilinowy, kw. p-kumarowy, kw. galusowy oraz kw. syrygnowy. Związki te wykazywały działanie antymikrobiologiczne w stosunku do szeregu bakterii, w tym E. coli, S. epidermidis i S. aureus metycylinowrażliwego oraz metycylinoopornego (MRSA). Związki fenolowe, z uwagi na mnogość ich występowania oraz zbliżone spektrum działania przeciwbakteryjnego w M. procera wydają się być najbardziej prawdopodobnym źródłem właściwości antymikrobiologicznych ekstraktów z M. konradii, jednak bez odpowiednich badań pozostaje to tylko tezą [6].
Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że 10% etyloceluloza jako nośnik wywierała duży wpływ na wzrost zarówno bakterii S. aureus, jak i E. coli. Odnotowano bowiem spadek ilości komórek bakteryjnych aż o 99,11% (E. coli, tab. 3) oraz o 92,98% (S. Aureus, tab. 4), spowodowany działaniem tej powłoki w stosunku do próby kontrolnej, którą stanowiła czysta folia PLA.
Przeprowadzone badania wykazały, że folie aktywne zawierające ekstrakt posiadały właściwości antybakteryjne względem ziarniaków oraz pałeczek nieznacznie wyższe niż powłoki z czystego nośnika. Analizując ich wpływ na drobnoustroje stwierdzono, że bardziej wrażliwy na działanie ekstraktu okazał się gronkowiec złocisty niż pałeczka okrężnicy. Odnotowano bowiem, że zawierająca ekstrakt powłoka ograniczyła wzrost E. coli jedynie o 0,58% bardziej niż powłoka z etylocelulozy, podczas gdy wzrost S. aureus został zahamowany bardziej o 4,61%. Uzyskane wyniki nie korespondują z rezultatami otrzymanymi dla czystego ekstraktu, w przypadku którego bardziej wrażliwa okazała się E. coli.
Podsumowując należy zauważyć, iż uzyskany z M. konradii ekstrakt okazał się substancją aktywną, która pomimo oddziaływania na oba analizowane gatunki bakterii nie nadaje się do wykonywania powłok aktywnych materiałów opakowaniowych. Dużo lepszym rozwiązaniem wydają się być chitozan [7], aldehyd cynamonowy [8], olejki eteryczne, a także ekstrakty roślinne [9]. Wymienione substancje znajdując się w powłoce na powierzchni folii PLA wykazują bardzo silną aktywność względem bakterii S. aureus.
Wnioski:
Ekstrakt z M. konradii pomimo posiadanych właściwości przeciwdrobnoustrojowych nie tworzy aktywnej powłoki z etylocelulozą.
Literatura
[1] Nowacka M., 2010: Nowa generacja opakowań ograniczających wzrost mikroorganizmów. Ważenie Dozowanie Pakowanie 04, 46-48
[2] Norma ASTM E 2180-01
[3] Dulger B., Yilmaz F., Gucin F., 2008: Antimicrobial Activity of Three Macrolepiota Species from Turkey. Asian Journal of Chemistry, Vol. 20, No 5, 3945-3948
[4] Dulger B., Yilmaz F., Gucin F., 1998: J. Kukem, 21, 7
[5] Alves M. J., Ferreira I. C., Froufe H. J., Abreu R. M., Martins A., Pintado M., 2013: Antimicrobial activity of phenolic compounds identified in wild mushrooms, SAR analysis and docking studies. J Appl Microbiol.; 115 (2): 346-5
[6] Kim K., Park K., Choi S. and Lee K., 2009: Macrolepiotin, a new indole alkaloid from Macrolepiota neomastoidea. The Journal of Antibiotics 62, 335-338
[7] Bonilla J., Fortunati E., Vargas M., Chiralt A., Kenny J. M. 2013. Effects of chitosan on physicochemical and antimicrobial properties of PLA films, J Food Eng, 119:236-243
[8] Makwana S., Choudhary R., Dogra N., Kohli P., Haddock J. 2014. Nanoencapsulation and immobilization of cinnamaldehyde for developing antimicrobial food packaging material. LWT – Food Science and Technology 57:470-476
[9] Erdohan Z.Ö., Çam B., Turhan K., N. 2013. Characterization of antimicrobial polylactic acid based films. Journal of Food Engineering 119:308-315
