Badania zostały przeprowadzone w ramach grantu nr 290098 sfinansowanego przez 7. Program Ramowy Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) – projekt NewGenPak.
1. Wstęp
Opakowania odgrywają kluczową rolę w ochronie żywności, a także w znacznym stopniu przyczyniają się do wydłużenia okresu przydatności do spożycia, co jest szczególnie istotne w przypadku opakowań aktywnych. Jedną z metod funkcjonalizacji opakowań aktywnych jest nanoszenie aktywnej powłoki, chociażby w ramach jednego z ostatnich etapów produkcji opakowania. Bardzo istotne jest unikanie podczas produkcji opakowania narażania aktywnych substancji na działanie podwyższonych temperatur, a także sił ścinających, co często zachodzi podczas końcowej obróbki (Coma, 2008). Naturalne substancje aktywne są bowiem bardzo podatne na warunki środowiskowe, a ich aktywność często jest uzależniona od obecności lotnych związków małocząsteczkowych. Przeważnie naturalne związki aktywne należą do olejków eterycznych, które znajdują się na liście substancji dopuszczonych do kontaktu z żywnością lub też nawet dodatków do żywności. Antymikrobiologiczna aktywność naturalnych olejków eterycznych jest badana od wielu lat (poczynając od co najmniej XIX wieku), zwłaszcza w kontekście konserwowania i przechowywania żywności, zastosowań farmaceutycznych, a także wybranych naturalnych sposobów leczenia (Kapoor, 2008; Lopes, 2011).
Jakość i różnorodność naturalnych substancji aktywnych, a zwłaszcza olejków eterycznych jest uzależniona od wielu czynników, w tym takich jak: czas zbiorów, części rośliny, z których otrzymywany jest ekstrakt, biotopu, a także warunków klimatycznych, w jakich roślina dojrzewała, jak również warunków, metod i parametrów procesu produkcji – w rezultacie skład poszczególnych olejków może się znacznie różnić (Papachristos 2004; Faleiro 2002; Marino 1999; Juliano, 2000).
Cynamon jest popularną przyprawą w przemyśle spożywczym, a jego liczne odmiany są powszechnie używane na całym świecie. Badania wskazują, że olejek z chińskiego cynamonu (Cinnamomum cassia), którego kluczowym składnikiem jest aldehyd cynamonowy (nawet powyżej 85%), ma bardzo dobre właściwości antymikrobiologiczne, nawet lepsze niż olejki cynamonowe pochodzące z innych źródeł (Pritam, 2013). Zarówno olejek, jak i aldehyd cynamonowy pochodzące z C. cassia wykazują wysoką aktywność antymikrobiologiczną względem szerokiego spektrum mikroorganizmów, z tym, że olejek cynamonowy jest znacznie tańszy niż czysty aldehyd cynamonowy (Ooi, 2006; Oussalah, 2006).
Artemisia argyi (chiński piołun) jest stosowany powszechnie do celów medycznych w Chinach i Japonii (Otsuka, 1992). Stare chińskie źródła podają, że liście tej rośliny były palone podczas epidemii ze względu na działanie dezynfekujące. Olejki eteryczne zawarte w tej roślinie stosowane są szeroko w medycynie chińskiej w leczeniu rozmaitych chorób (np. problemów z wątrobą, nerkami czy też śledzioną) (Bian, 1990; Bian, 1981), a także w leczeniu infekcji/zakażeń spowodowanych przez grzyby, bakterie i wirusy (Abad, 2012). W ostatnich czasach przeprowadzono szereg badań wskazujących na wysoką aktywność antymikrobiologiczną olejków eterycznych ekstrahowanych z chińskiego piołunu, zwłaszcza względem bakterii Gram dodatnich (Hu, 2013; Wang, 2006), podkreślono efekt antyhistaminowy (Bian, 1981), własności antyoksydacyjne (Huang, 2012) i aktywność antygrzybiczną (Wenqiang, 2006).
Aby stosować takie naturalne związki jako składniki emulsji powłokotwórczej (do aktywnych powłok), należy oszacować wpływ czynników fizykochemicznych na potencjalną aktywność antymikrobiologiczną, bowiem zgodnie z nielicznymi źródłami literaturowymi (niewielka ilość badań przeprowadzonych w tym zakresie) olejki eteryczne są wrażliwe chociażby na pH, stosowaną temperaturę czy też na obecność potencjalnych surfaktantów w emulsji (Coma, 2008). Z tego względu olejki powinny być oceniane indywidualnie w specyficznych warunkach fizykochemicznych pod kątem potencjalnego zastosowania. W ramach niniejszej pracy podjęto próbę oszacowania wpływu pH oraz temperatury na właściwości antymikrobiologiczne wybranych olejków eterycznych, stanowiących składnik emulsji powłokotwórczej do nanoszenia na materiały opakowaniowe jako aktywna powłoka.
2. Materiały i metody
Olejki eteryczne
Chiński olejek cynamonowy oraz chiński olejek piołunowy zostały kupione w firmie Jiangxi Global Natural Spice Co. Ltd., Chiny. Zgodnie z informacją od producenta, olejek cynamonowy został uzyskany z kory chińskiego Cinnamomum cassia; olejek zawiera 75-80% aldehydu cynamonowego. Natomiast chiński olejek piołunowy został wyekstrahowany z liści Artemisia argyi i zawiera 60-65% tujonu i alkoholu tujonowego (ilość olejku aplikowana w emulsji na powłoki pozostaje poniżej dopuszczalnych norm). Oba rodzaje olejków ekstrahowano za pomocą destylacji parowej. Są one rozpuszczalne w etanolu i acetonie, nie są rozpuszczalne w wodzie.
Mikroorganizmy
Do testów użyto szczepu referencyjnego Staphylococcus aureus (ATCC 6538P, kolekcja DSMZ). Przygotowane inoculum zawierało 1-2x108 CFU/ml (co potwierdzono przy użyciu Biochrom WPA CO8000 – pomiar gęstości komórek bakteryjnych).
Przygotowywanie emulsji powłokotwórczej i oznaczanie minimalnego stężenia olejków hamującego wzrost komórek bakteryjnych (MIC)
Emulsja powłokotwórcza na bazie skrobi modyfikowanej zawierająca poszczególne olejki w ilości 30% obj. została przygotowana przy użyciu Tween 20 (Sigma Aldrich, Niemcy) w ilości 10% obj. w stosunku do zawartości olejku eterycznego. Składniki emulsji mieszano poprzez sonifikację (procesor ultradźwiękowy UP400S, 400 W, 24 kHz) przez 5 minut. Oznaczenie wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) przeprowadzono używając metody rozcieńczeniowej. W rezultacie uzyskano stężenia: 3; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 i 0,01% obj. emulsji w płynnej pożywce TSB (Merck, Niemcy). Następnie do przygotowanych wcześniej układów dodawano inoculum zawierające Staphylococcus aureus. Dla każdej próbki wykonano trzy powtórzenia. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C przygotowano dziesięciokrotne rozcieńczenia, które wysiewano na płytki z pożywką. Jako minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii wskazywano stężenie, dla którego nie odnotowano już wzrostu bakterii.
Oznaczanie stabilności emulsji powłokotwórczej
Aby oszacować przydatność i stabilność opracowanej emulsji do powlekania materiałów opakowaniowych, oznaczono rozkład wielkości cząstek (Mastersizer 2000, Malvern Instruments, Wielka Brytania, z przystawką Hydro2000MU) zarówno bezpośrednio po przygotowaniu, jak i po 24 godzinach. Pomiary wykonywano w temperaturze pokojowej, jako nośnik stosowano wodę destylowaną, pomiary wykonywano w trzech powtórzeniach.
Ocena wpływu temperatury i pH na aktywność antymikrobiologiczną emulsji
Aby oszacować wpływ pH na aktywność antymikrobiologiczną, przygotowano pożywkę płynną TSB (Merck, Niemcy) w trzech różnych stężeniach: 5,0; 7,0 i 8,0 wykorzystując w tym celu 0,5 M kwas solny (HCl) lub zasadę sodową (NaOH). Jednocześnie przygotowano emulsję (30% obj. olejku, 10% obj. Tween w stosunku do olejku), tak aby proporcja emulsji do pożywki pozwoliła uzyskać końcowe stężenie olejku cynamonowego 0,1% i olejku piołunowego 0,5% w stosunku do całego układu (dobrane stężenia wynikały z oznaczonego wcześniej minimalnego stężenia inhibitującego; były to stężenia niższe niż oznaczone MIC). Inoculum Staphylococcus aureus dodawane było odpowiednio do poszczególnych układów. Próba kontrolna nie zawierała olejków. Wszystkie układy przygotowano w 3 powtórzeniach. Po
24 godzinach inkubacji w 37°C oznaczono ilość jednostek tworzących kolonie (metoda rozcieńczeń).
W celu oznaczenia wpływu temperatury wykonano analogiczne testy, z tą różnicą, że pH pożywki wynosiło 7,0, natomiast próbki były inkubowane przez 24 godziny w różnych temperaturach: 4, 20 i 37°C.
Aktywność antymikrobiologiczna
Aktywność antymikrobiologiczna była oznaczana jako logarytmiczna redukcja mikroorganizmów, zgodnie z równaniem:
R (średnia log redukcja CFU/ml) = log (B) – log (C),
gdzie: B – średnia ilość jednostek tworzących kolonię próby kontrolnej po oznaczonym czasie, natomiast C – to średnia ilość jednostek tworzących kolonie badanej próbki po oznaczonym czasie.
3. Wyniki i dyskusja
Stabilność emulsji powłokotwórczej
Rozkład wielkości cząstek dla emulsji bezpośrednio po przygotowaniu i po 24 godzinach wskazuje, że emulsje zawierające zarówno olejek cynamonowy, jak i piołunowy są stabilne (brak zmian po 24 godzinach) (rys. 1.).
Dodatkowo stwierdzono, że dodatek emulgatora (10% obj. w stosunku do olejku) również nie ma negatywnego wpływu na stabilność emulsji.
Minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii
Najniższe stężenie olejku, przy którym nie odnotowano wzrostu mikroorganizmów, zostało oznaczone jako minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii. Wyniosło ono odpowiednio dla emulsji zawierającej chiński olejek cynamonowy – 0,3% obj., a dla olejku piołunowego – 1,0% obj. Ponadto aktywność antymikrobiologiczna była także uzależniona od obecności emulgatora oraz warunków fizykochemicznych testu, co zostanie omówione w dalszej części.
Wpływ pH oraz temperatury
W tabeli 1 oraz na wykresie (rys. 2.) przedstawiono wyniki aktywności antymikrobiologicznej w zależności od pH dla emulsji powłokotwórczych zawierających olejek cynamonowy oraz olejek piołunowy względem Staphylococcus aureus.
Ze względu na fakt, że w badaniach użyto dwóch różnych stężeń jednego i drugiego olejku (co wynikało z różnych wartości minimalnego stężenia hamującego), trudno porównać aktywność obu olejków. Jednakże w obu przypadkach można zaobserwować podobny trend, bowiem w miarę podwyższania pH aktywność antymikrobiologiczna spada. Wyniki te potwierdzają niekorzystny wpływ podwyższania pH na aktywność olejków eterycznych, które są najskuteczniejsze w niskich wartościach pH (np. olejek czosnkowy czy też miętowy – Gutierrez, 2009; Mahfuzul, 2008). W niektórych jednak przypadkach olejki eteryczne są skuteczniejsze w pH obojętnym lub lekko alkalicznym – np. olejek eteryczny z Plectranthus amboinicus (Goncalves, 2012). Potencjalnie wytłumaczeniem ograniczenia aktywności antymikrobiologicznej olejków w wyższym pH może być zmiana kąta zwilżania i odmienne działanie olejków eterycznych w kontakcie ze ścianą komórkową bakterii, jednak ta teoria wymaga jeszcze dalszych badań.
Jeśli chodzi o wpływ temperatury, zaobserwowano podobny trend (rys. 3.): im wyższa temperatura, tym aktywność antymikrobiologiczna olejków była wyższa (należy podkreślić fakt, że badany Staphylococcus aureus nie należy do szczepów preferujących niskie temperatury). Jednocześnie widać różnicę w zachowaniu poszczególnych olejków; piołunowy jest zdecydowanie bardziej aktywny w podwyższonej temperaturze (co być może świadczy o uwalnianiu lotnych aktywnych związków małocząsteczkowych).
W przypadku innych olejków, badanych przez innych naukowców, wskazuje się na przykład, że aktywność antymikrobiologiczna olejku goździkowego pozostaje niezmieniona w szerokim zakresie temperatury: 4-100°C (Karkosh, 2012); w przypadku olejku eterycznego z Satureja thymbra najwyższą aktywność stwierdzono z kolei w niskich temperaturach (Boziaris, 2011). Różnice w aktywności antymikrobiologicznej wynikają najczęściej z różnicy w składzie, olejki zawierają bowiem różne związki, bardziej i mniej aktywne, a także bardziej i mniej lotne. Dodatkowo temperatura ma wpływ na aktywność/lotność poszczególnych komponentów, zwłaszcza związków małocząsteczkowych.
Podkreślić należy, że często olejki mogą działać w odmienny sposób w zależności od badanego szczepu bakteryjnego, a ich mechanizm działania może się różnić (Bassole, 2012; Burt, 2007; Hayouni 2008; devi, 2010; Trombetta, 2005). Sam mechanizm aktywności antymikrobiologicznej może polegać na hamowaniu działania ochronnych enzymów, zdolności poszczególnych związków do oddziaływania na ścianę komórkową bakterii czy też wzajemnej interakcji białek lub enzymów.
Obecnie duże wyzwanie w badaniach dotyczących aktywnych emulsji powłokotwórczych do zastosowania jako powłoki na materiałach opakowaniowych przeznaczonych do pakowania na przykład żywności stanowi taki dobór aktywnych składników, które działają na jak najszersze spektrum bakterii i grzybów. Dodatkowym wyzwaniem jest w przypadku naturalnych substancji wyeliminowanie ich – bardzo często – niezwykle silnego zapachu, tak, aby opakowanie stanowiło neutralną sensorycznie ochronę dla pakowanego produktu.
4. Wnioski
W przypadku obu badanych olejków stwierdzono wysoką aktywność antymikrobiologiczną, uzależnioną jednak od warunków środowiskowych, takich jak pH czy też temperatura; jednakże ich wysoka aktywność umożliwia ich stosowanie jako komponentu emulsji powłokotwórczej, która może znaleźć zastosowanie jako aktywna powłoka nanoszona na materiały opakowaniowe przeznaczone do pakowania żywności. Obecnie wciąż trwają prace nad weryfikacją aktywności antymikrobiologicznej powłok, opracowanych na bazie opisanej wyżej emulsji dodawanej do komercyjnych farb i lakierów stosowanych w przemyśle papierniczym/opakowaniowym. Aby obniżyć koszty i zredukować konieczność modyfikacji instalacji przemysłowych, opracowana w niniejszej pracy emulsja ma stanowić dodatek do komercyjnych farb i lakierów i może być nanoszona w obróbce końcowej materiału opakowaniowego.
Literatura:
1. Bian, R. L. (1990). Antiasthmatic action and components of the Chinese herb Artemisia-argyi. Euro. J. Pharm. 183: 226-227
2. Bian, R. L. (1981) Pharmacological studies on the antiasthmatic principle of essential oil of Artemisia argyi--terpinenol-4 (author’s transl). Zhonghua Jie He He Hu Xi Xi Ji Bing Za Zhi 1981, 4, 203-206
3. Boziaris, IS, et al. (2011) Effect of Satureja thymbra essential oil on growth-no growth interfaces of Listeria monocytogenes Scott A and Salmonella Enteritidis PT4, at various temperatures, pH, and water activities. J Food Prot. Jan; 74 (1): 45-54
4. Burt, S, (2004) Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods-a review. International Journal of Food Microbiology, 94 (3), pp. 223-253
5. Burt, S. A.; et al. (2007), Carvacrol induces heat shock protein 60 and inhibits synthesis of flagellin in Escherichia coli O157: H7. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4484-4490
6. Coma V. (2008) Bioactive packaging technologies for extended shelf life of meat-based products. Meat Sci. Jan; 78 (1-2): 90-103
7. Delves-Broughton, J. 2005. Nisin as a Food Preservative. Food Australia 57, 525-527
8. Gonçalves TB. (2012) effect of subinihibitory and inhibitory concentrations of Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng essential oil on Klebsiella pneumoniae. Phytomedicine. Aug 15; 19 (11): 962-8
9. Gutierrez J et al. (2009) Food Microbiol. Antimicrobial activity of plant essential oils using food model media: efficacy, synergistic potential and interactions with food components. Apr; 26 (2): 142-50
10. Hayouni, E, et al. (2008). Mechanism of action of Melaleuca armillaris (Sol. Ex Gaertu) Sm. Essential oil on six LAB strains as assessed by multiparametric flow cytometry and automated microtiter-based assay.
Food Chem. 111, 707-718
11. Hu Y et al. (2013) Facile preparation of artemisia argyi oil-loaded antibacterial microcapsules by hydroxyapatite-stabilized Pickering emulsion templating. Colloids Surf B Biointerfaces. Dec 1; 112:96-102
12. Huey-Chun Huang. (2012) Dual Bioactivities of Essential Oil Extracted from the Leaves of Artemisia argyias an Antimelanogenic versusAntioxidant Agent and Chemical Composition Analysis by GC/MS Int. J. Mol. Sci, 13, 14679-14697
13. Imaël Henri Nestor Bassolé 1,(2012) and H. Rodolfo Juliani 2. Essential Oils in Combination and Their Antimicrobial Pr
operties. Molecules 2012, 17 (4), 3989-4006
14. Julianoa C., Mattana A., Usaia M., (2000) Composition and in vitro Antimicrobial Activity of the Essential Oil of Thymus herba-barona Loisel Growing Wild in Sardinia. Journal of Essential Oil ResearchVolume 12, Issue 4
15. Kapoor, I. P. S. et al. (2008). Journal of food processing and preservation, 32 (5), 719-728
16. Karkosh A. S. A., (2012). Euphrates Journal of Agriculture Science-4 (1): 15-19
17. Kienholz, M. (1959). Studies on the antibacterial action of ethereal oils. Arzneimittel-Forschung/Drug Research 9, 519-21
18. Lopes et al. (2011). Flavoring and antimicrobial film for food products. (P99)
19. María José Abad et al.(2012). The ArtemisiaL. Genus: A Review of Bioactive Essential Oils. Molecules 17, 2542-2566
20. Marino M1, Bersani C, Comi G. (1999). Antimicrobial activity of the essential oils of Thymus vulgaris L. measured using a bioimpedometric method. J Food Prot. Sep; 62 (9): 1017-23
21. Mahfuzul HM, Bari ML, Juneja VK, Kawamoto S. (2008). Antimicrobial activity of Colves and Cinnamon extracts against food borne pathogens and spoilage bacteria, and Inactiveation of listeria monocytogenes in ground chicken meat with their essential oils. Rep. National Food Research Institute, 72 (9), 21
22. Ooi LS, Li Y, Kam SL, Wang H, Wong EY, Ooi VE. (2006) Antimicrobial activities of cinnamon oil and cinnamaldehyde from the Chinese medicinal herb Cinnamomum cassia Blume. Am J Chin Med. 34 (3): 511-22
23. Otsuka, K.; Shoji, J.; Takido, M.; Cho, S. (1992). A Pictorial Encyclopedia of Chinese Medical Herbs (I); Chuokoran-Sha Inc.: Tokyo, Japan
24. Oussalah M, Caillet S, Lacroix M. (2006) Mechanism of action of Spanish oregano, Chinese cinnamon, and savory essential oils against cell membranes and walls of Escherichia coli O157: H7 and Listeria monocytogenes. J Food Prot. May; 69 (5): 1046-55
25. Pandima Devi, et al. (2010). Eugenol (an essential oil of clove) acts as an antibacterial agent against Salmonella typhi by disrupting the cellular membrane. J. Ethnopharmacol. 130, 107–115
26. Papachristos, D. P., Karamanoli, K. I., Stamopoulos, D.C. & Menkissoglu-Spiroudi, U. (2004). The relationship between the chemical composition of three essential oils and their insecticidal activity against Acanthoscelides obtectus (Say). Pest Management Science, 60 (5), 514-520
27. Pritam D. N, Hemant G. et al. (2013) Comparison of antimicrobial activity of Cinnamomum zeylanicum and Cinnamomum cassia on food spoilage bacteria and water borne bacteriaDer Pharmacia Lettre 2013 5 (1): 53-59
28. Shigeharu Inouyea, (2001). Toshio Takizawab and Hideyo Yamaguchia. Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respiratory tract pathogens by gaseous contact. J. Antimicrob. Chemother. (2001) 47 (5): 565-573
29. Trombetta, D et al. (2005). Mechanisms of antibacterial activity of three monoterpenes. Agents Chemother. 49, 2474–2478
30. Wang wei et al. (2006). Antimicrobial activities of essential oil from Artemisiae argyi leaves. Journal of Forestry Research, 17 (4): 332−334
31. Wenqiang, G.; Shufen, L.; Ruixiang, Y.; Yanfeng, H. (2006). Comparison
of composition and antifungal activity of Artemisia argyi Levl. et Vant inflorescence essential oil extracted by hydrodistillation and supercritical carbon dioxide. Nat. Prod. Res. 20, 992–998
