Wstęp
Opakowania stosowane są głównie w celu ochrony produktu, jaki się w nich znajduje. W miarę rozwoju rynku towarów również one uległy przemianom, co było związane z poszerzaniem się zakresu funkcji, jakie musiały spełniać [2,4,6]. Obecnie intensywnie rozwijany jest rynek tzw. opakowań aktywnych. Termin ten dotyczy opakowań, które oprócz tradycyjnej funkcji izolowania produktu spożywczego od środowiska zewnętrznego aktywnie oddziałują na produkt lub atmosferę wewnątrz opakowania, a więc wpływają na poprawę jakości lub przedłużają czas bezpiecznego przechowywania produktu [2,3,6]. Opakowania o właściwościach antymikrobiologicznych mogą być powlekane nośnikiem zawierającym substancję aktywną, mającą chronić zapakowaną żywność przed działaniem drobnoustrojów. Ponadto powinny być bezpieczne dla konsumentów (dopuszczone do kontaktu z żywnością), zachowywać aktywność w opakowaniu nawet w trakcie długotrwałego przechowywania oraz wolno migrować z opakowania do produktu lub – w przypadku związków lotnych – do wolnej przestrzeni nad produktem [2,3,4]. Najczęściej stosowanymi substancjami aktywnymi wprowadzanymi do powłok są substancje organiczne takie jak kwas sorbowy czy sorbinian potasu [5,7,10]. Alternatywę mogą stanowić produkowane przez drobnoustroje egzopolisacharydy [9] lub ich mieszanina ze znanymi związkami chemicznymi [9,12].
Celem pracy była próba uzyskania właściwości przeciwbakteryjnych folii PLA poprzez naniesienie na nią powłok zawierających substancje bioaktywne.
Materiał i metody
Do przeprowadzenia doświadczeń wykorzystano folię PLA Biophan 121 o grubości 20 µm (uzyskaną od producenta X). Folię cięto na arkusze A4, a następnie pokrywano różnymi wariantami powłok. Materiał badawczy stanowiły także nośniki: metyloceluloza (MC) oraz metylohydroksypropyloceluloza (MHPC). Do obniżenia pH substancji nośnikowej wykorzystano kwas octowy. Próby kontrolne stanowiły folie PLA. Do przeprowadzenia doświadczeń wykorzystano cztery szczepy bakteryjne pozyskane z Niemieckiej Kolekcji Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), jeden szczep zakupiony z Kolekcji Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej we Wrocławiu (IIiTD) oraz jeden szczep otrzymany z kolekcji Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu (KBiMŻ). Wykorzystano następujące mikroorganizmy:
n Arthrobacter viscosus DSM 7307 – szczep produkujący egzopolisacharyd o właściwościach przeciwbakteryjnych [9]
n Bacillus atrophaeus DSM 675 IZT
n Escherichia coli DSM 498 JIS
n Micrococcus luteus DSMZ 20729
n Staphylococcus aureus (IIiTD Wrocław)
n Citrobacter freundii (KBiMŻ)
Do hodowli A. viscosus użyto pożywki stałej oraz płynnej, przygotowanych zgodnie z zaleceniami DSMZ.
Skład pożywki był następujący:
n Pożywka płynna (YM bulion): 1000 ml wody destylowanej, ekstrakt drożdżowy 3,0 g (BTL Sp. z o.o., Polska); malt ekstrakt 3,0 g (MERCK KGaA, Niemcy), pepton 5,0g (MERCK KGaA, Niemcy).
n Podłoże stałe (YM agar): 1000 ml wody, ekstrakt drożdżowy 3,0 g (BTL Sp. z o.o., Polska); malt ekstrakt 3,0 g (MERCK KGaA, Niemcy); pepton 5,0 g (MERCK KGaA, Niemcy); agar 15,0 g; glukoza 1 g (CHEMPUR, Polska).
Do hodowli pozostałych szczepów wykorzystano pożywki TSB (MERCK KGaA, Niemcy) oraz TSA (MERCK KGaA, Niemcy). Podłoża zostały wykonane zgodnie z protokołem firm.
Do modyfikacji powłok użyty został także preparat NovaSOL DC/44 (AQUA NOVA), który ma postać nano-miceli o wielkości 30 nm, zawiera 4% kwasu sorbowego oraz 4% kwasu benzoesowego.
Proces syntezy zewnątrzkomórkowego EPS przez A. viscosus prowadzono podczas hodowli okresowej w kolbach stożkowych zgodnie z metodyką przedstawioną przez Mizielińską i wsp. [9]. Uzyskany egzopolisacharyd (po jego oddzieleniu od biomasy) podzielono na dwie części, rozlano do czystych naczyń i zważono (RADWAG WPS 210/C/2, Polska). Do jednej z zawiesin z EPS dodano metylohydroksypropyloceluloza (MHPC), do drugiej metylocelulozę (MC). Otrzymano 4% roztwory nośników w zawiesinach EPS. Do tak przygotowanych roztworów dodano preparat NovaSOL DC/44, tak by uzyskać jego 1% zawartość w roztworach. Całość mieszano przez 24 h, po czym pH roztworów doprowadzono do wartości 3,7 za pomocą kwasu octowego. Następnie całość homogenizowano (Homogenizer typ 302, Mechanika Precyzyjna, Polska).
Tak przygotowane roztwory (tj. nośnik z substancją aktywną) naniesiono na arkusze folii PLA i rozprowadzono za pomocą powlekarki (UNICOATER 409, Erichsen, Niemcy). Czysta, niepowlekana folia stanowiła próbę kontrolną (oznaczoną jako „K”). Każdą z próbek nanoszono na arkusz folii formatu A4 w ilości 1 ml za pomocą dwóch różnych wałków, uzyskując grubości warstwy mokrej 50 µm (próby oznaczone 1.50 i 2.50) oraz 100 µm (próby oznaczone 1.100 i 2.100). Pokryte folie suszono 15 minut w 55°C. Zawartości substancji aktywnej w powłokach stabelaryzowano (tab. 1):
Do zbadania właściwości antymikrobiologicznych powlekanych folii wykorzystano wzorcową metodę badawczą służącą do określenia aktywności czynnika antymikrobiologicznego włączonego w polimerowe lub hydrofobowe materiały, oznaczoną normą ASTM E 2180-01 [1].
Wyniki i dyskusja
Wykorzystywane do pokrywania opakowaniowych folii PLA metylohydroksypropyloceluloza oraz metyloceluloza nie wykazują właściwości przeciwdrobnoustrojowych. Przeprowadzone przez M. Imran i in. [8] doświadczenia, w których przebadano 16 szczepów powszechnie występujących w żywności bakterii, wykluczyły posiadanie właściwości antymikrobiologicznych przez metylohydroksypropylocelulozę. Nie znaleziono również danych na temat posiadania takich cech przez metylocelulozę. Związki te stanowią natomiast dobry nośnik powłokotwórczy dla substancji aktywnych. Odnotowano, że ograniczają one wzrost bakterii Gram-ujemnych, jeśli wprowadzi się do nich związki chemiczne takie jak sorbinian potasu czy emulsja zawierająca 4% kwas sorbowy oraz 4% kwas benzoesowy [10]. Z kolei pokrywanie opakowaniowej folii polilaktydowej egzopolisacharydem syntetyzowanym przez Arthrobacter viscosus pozwala na uzyskanie powłoki wykazującej aktywność względem bakterii Gram-dodatnich. Powłoka z EPS może ograniczyć bowiem wzrost komórek Micrococcus luteus o ponad 99%, bakterii Staphylococcus aureus o ponad 98% oraz laseczek Bacillus atrophaeus o 88%. Egzopolisacharyd nie hamuje niestety wzrostu bakterii Gram-ujemnych [9]. Dlatego założono, że mieszanina preparatu NovaSOL DC/44 i egzopolisacharydu syntetyzowanego przez A. viscosus w nośnikach powłokotwórczych takich jak MHPC oraz MC pozwoli na uzyskanie uniwersalnej powłoki wykazującej aktywność zarówno względem bakterii Gram-ujemnych, jak i względem bakterii Gram-dodatnich.
Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono, że znajdująca się w powłokach mieszanina substancji aktywnych, tj. syntetyzowanego przez A. viscosus egzopolisacharydu oraz preparatu NovaSOL DC/44, w sposób istotny ograniczyła wzrost pałeczek E. coli; lepszym przy tym nośnikiem okazała się metylohydroksypropyloceluloza (tab. 2, rys. 1). Dodać należy, że ważna dla właściwości antybakteryjnych względem E. coli okazała się ilość substancji aktywnych w powłoce. Im większa była zawartość tych substancji zarówno w MHPC, jak i w MC (czyli im większa była grubość warstwy mokrej), tym większe było ograniczenie wzrostu komórek pałeczki okrężnicy. Gram (-) komórki C. freundii okazały się mniej wrażliwe na otrzymane powłoki. Zanotowano nieznaczną ich redukcję na foliach pokrytych egzopolisacharydem z Novasol, których nośnikiem była MHPC. Co ciekawe, zauważono znaczną różnicę redukcji ilości komórek bakteryjnych pomiędzy foliami, które różniły się nośnikami oraz grubością powłoki. Ponad czterokrotnie większą aktywnością antymikrobiologiczną względem C. freundii charakteryzowały się folie, w których nośnikiem była MC. Należy również zauważyć, że folia o grubości warstwy mokrej 100 µm, w któ-
rej powłoce nośnikiem była MHPC zawierająca 26,7 mg/dm2 (EPS) oraz 10 mg/dm2 (NovaSOL DC/44) substancji aktywnych miała zbliżone właściwości do folii o grubości 50 µm, z nośnikiem MC, która zawierała o połowę mniej substancji aktywnych (13,35 mg/dm2 i 5 mg/ dm2).
Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono także, że zawierające modyfikowane powierzchnie folie PLA wykazywały wysoką aktywność względem M. luteus. Największą aktywnością przeciwko tym ziarniakom charakteryzowała się powłoka o grubości warstwy mokrej 100 µm, w której nośnikiem była MC (tab. 3, rys. 2). Odnotowano ponadto wpływ zawartości substancji aktywnych na wzrost komórek M. luteus, gdy nośnikiem była MC.
Uzyskane w ramach przeprowadzonych doświadczeń rezultaty pozwoliły na stwierdzenie, że otrzymane powłoki wykazywały najwyższą aktywność względem S. aureus. Najlepszy wynik otrzymano dla powłoki o grubości warstwy mokrej 100 µm, w której nośnikiem substancji aktywnych była MHPC, o czym świadczy najmniejsza liczba komórek bakteryjnych tego gatunku (rys. 2). Należy zauważyć, że dwukrotny wzrost grubości powłoki, w której substancją nośną była MC, wpłynął negatywnie na redukcję ilości S. aureus. Odnotowano bowiem niewielki wzrost ilości tych komórek po kontakcie z omawianą powłoką. W przypadku komórek B. atrophaeus najlepszymi właściwościami antybakteryjnymi charakteryzowała się folia PLA powlekana egzopolis
acharydem oraz preparatem Novasol CD/44, w której nośnikiem była MHPC. Stwierdzono ponadto, że im większa była zawartość substancji aktywnych w powłokach, tym większe było ograniczenie wzrostu B. atrophaeus.
Porównując aktywność powlekanych, biodegradowalnych folii PLA względem bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych w kierunku wytworzenia proekologicznego opakowania o właściwościach antymikrobiologicznych można stwierdzić, że tak zmodyfikowane folie wykazały aktywność zarówno względem bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych. A zatem uzyskano uniwersalną, aktywną powłokę, o poprawionych dzięki EPS właściwościach barierowych [9]. Dodać jednak należy, że mikroorganizmy Gram-dodatnie bez względu na to, czy były to ziarniaki, czy zawierające przetrwalniki laseczki wydawały się być bardziej wrażliwe na otrzymane powłoki niż Gram-ujemne pałeczki.
Podobne doświadczenia przeprowadzili także inni autorzy [12]. Wprowadzili oni mieszaninę substancji aktywnych, tj. kwasu cytrynowego oraz nizyny do nośnika powłokotwórczego i stworzyli bardzo efektywną powłokę względem M. luteus. Nośnikiem wykorzystanym do wytworzenia powłoki była 4,5% MHPC, zawierająca 1% nizyny oraz 15% kwasu cytrynowego. Procent redukcji M. luteus dla tej powłoki wynosił 100%. Natomiast wyniki prezentowane w tej pracy dowiodły, że kiedy powłoka zawierała NovaSOL DC/44 oraz syntetyzowany przez A. viscosus egzopolisacharyd, wyższą redukcję komórek M. luteus uzyskano, gdy nośnikiem była metyloceluloza. Istotny jest także fakt, że wykorzystywana przez wielu autorów nizyna wykazuje zupełny brak aktywności względem bakterii Gram-ujemnych, co może stanowić problem w sytuacji, w której opakowanie powinno ograniczać wzrost tych drobnoustrojów. Podobnie Y. Pranoto i in. [11] otrzymali powłokę (zawierającą 1,28 mg/g chitozanu) o doskonałych właściwościach antymikrobiologicznych względem bakterii Gram-dodatnich takich jak S. aureus, Listeria monocytogenes i Bacillus cereus. W tym przypadku także nie uzyskano pożądanej aktywności względem mikroorganizmów Gram-ujemnych.
Wnioski:
Zawartość mieszaniny substancji aktywnych w tworzonych powłokach ma wpływ na aktywność modyfikowanych folii.
Wytworzona powłoka (o grubości warstwy mokrej 100 µm) złożona z syntetyzowanego przez A. viscosus egzopolisacharydu oraz preparatu NovaSOL DC/44 wykazuje dobre właściwości antymikrobiologiczne względem bakterii Gram-dodatnich oraz Gram-ujemnych bez względu na rodzaj zastosowanego nośnika.
Nośnikiem, który w połączeniu z substancjami aktywnymi (bez względu na grubość powłoki) w sposób istotny redukował liczbę komórek większości z badanych szczepów, była MHPC.
Literatura:
1. ASTM: Standard Test Method for Determining the Activity of Incorporated Antimicrobial Agent (s) in Polymeric or Hydrophobic Materials. E 2180-01
2. Bartkowiak A., Mizielińska M., Sumińska P., Romanowska-Osuch A., Lisiecki S. 2016, Innovations in food packaging materials In: „Emerging and Traditional Technologies for Safe, Healthy and Quality food”. Pod red. Nedovic, Raspor, Lević, Tumbas, Barbosa-Canovas W: „Emerging and Traditional Technologies for Safe, Healthy and Quality food”, Springer, 383-412
3. Coma V., 2008. Bioactive packaging technologies for extended shelf life of meat-based products. Meat Sci. 78, (1-2), Symposium of Meat Safety: From Abbatoir to Consumer, 90-103
4. Davidson P. M., Brannen A. L., 1993, Antimicrobials in Foods. Marcel Dekker INC., New York, 11-91
5. Guillard V, Issoupov V, Redl A, Gontard N, 2009, Food preservative content reduction by controlling sorbic acid release from a superficial coating. Innov. Food Sci. Emerg. 10, 108-115
6. Han JH., 2000, Antimicrobial food packaging. Food Technol. 54 (3), 56-55
7. Hauser C., Wunderlicha J., 2011, Antimicrobial packaging films with a sorbic acid based Coating, Procedia, Food Sci. 1, 197-202
8. Imran M., El-Fahmy S., Revol-Junelles M. A., Desobry S., Imran M., El-Fahmy S., Revol-Junelles M. A., Desobry S. 2010, Cellulose derivative based active coatings: Effects of nisin and plasticizer on physico-chemical and antimicrobial propertiesof hydroxypropyl methylcellulose films, Carbohyd. Polym. 81, 219-225
9. Mizielińska M., Lisiecki S., Jędra F., Kowalska U., Tomczak A. 2015, Właściwości barierowe i antymikrobowe folii polilaktydowej pokrytej egzopolisacharydem syntetyzowanym przez Arthrobacter vicosus. Przem. Chem. 94 (5), 748-751
10. Mizielińska M., Sumińska P., Kuźmicz U., Lisiecki S., Bartkowiak A. 2014, Aktywność antymikrobiologiczna powłok na foliach opakowaniowych PLA względem bakterii E. coli, Opakowanie, 6, 66-70
11. Pranoto Y., Rakshit S. K., Salokhe V. 2005, Enhancing antimicrobial activity of chitosan films by incorporating garlic oil, potassium sorbate and nisin, LWT, 38, 859-865
12. Sebti I., Delves-Broughton J., Coma V., Sebti I., Delves-Broughton J., Coma V. 2003, Physicochemical properties and bioactivity of nisin-containing, J. Agric. Food Chem. 51, 6468-6474
